麋鹿AFLP分子标记系统的建立及其遗传多样性评估

摘要

麋鹿（Elaphurus davidianus）是我国I级重点保护的珍稀濒危动物，野生种群在经历了商周的鼎盛时期之后开始走向衰落。至十九世纪未，麋鹿在我国本土灭绝，而早期自我国引入欧洲的仅存18只个体被集中散放于英国的乌邦寺庄园，成为了全球现今3000多只麋鹿的奠基种群。
　　 第一次世界大战后，乌邦寺的麋鹿种群日渐扩大，并开始“对外输出”。其中，北京南海子“北京麋鹿生态实验中心”于1985年重引入糜鹿38只，建立了麋鹿自本土灭绝以来我国的第一个人工散放式半放养种群。
　　 然而，麋鹿在经历了十九世纪末极其严重的“瓶颈效应”以及其后乌邦寺庄园“对外输出”的多次“间歇性瓶颈效应“之后，究竟还保留着怎样的遗传多样性这一科学问题，一直深受学术界的关注。鉴此，本文在“建立AFLP分子标记检测体系”的基础上，通过对北京南海子“北京麋鹿生态实验中心”245只麇鹿的AFLP检测，获得了遗传多样性的相关参数，初步解答了学术界关注的上述问题，其主要结果报告于后：
　　 一、麇鹿AFLP分子标记系统的建立
　　 (1)提取高质量、无降解的基因组DNA。
　　 (2)200-400ng的基因组DNA于37℃经0.5U的EcoRI和Mse I限制性双酶切2h，后20℃接头连接2h。
　　 (3)1％琼脂糖凝胶电泳检测，酶切和连接产物在100-1500bp范围，且呈均匀的弥散状分布。
　　 (4)两次PCR扩增前模板DNA均1:10稀释，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，其预扩增产物主要在100-800bp范围且呈典型的弥散状分布。
　　 (5)6.5％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测选择性扩增产物，分子量大小分布在50-700bp范围。
　　 二、麋鹿遗传多样性的AFLP检测利用从64对引物组合中筛选出的E-AAC/M-CAG、E-AAC/M-CAT、E-AAG/M-CTC、E-AAG/CTG、E-ACC/M-CAC、E-ACC/M-CTT、E-ACT/M-CAC、E-ACT/M-CTA、E-AGC/M-CTA、E-AGC/CTT及E-AGG/M-CTT等11对多态性引物组合进行种群的遗传多样性检测，获得了如下结果：
　　 (1)在获得的1086个标记位点中，75个为多态位点。各引物组合多态百分率(PPL)在3.70％-10.91％之间，群体平均多态百分率(PPL)为6.91％。
　　 (2)11对引物组合的75个多态位点的个体累积识别率达100％，此AFLP分子标记完全能够区分“北京麋鹿生态实验中心”麇鹿种群的所有个体，即该麇鹿种群的每只个体均具有本文所建立的独有的AFLP指纹图谱。
　　 (3)种群的观察等位基因数(Na)为1.0675，有效等位基因数(Ne)为1.0379，Nei's基因多样性指数(H)为0.0230，Shannon信息指数(I)为0.0349，个体间最大的遗传距离为0.001816，最小者为0.000120，个体之间平均遗传相似系数为0.999057士0.0002782。这些参数结果表明了“北京麋鹿生态实验中心”麇鹿种群所有个体间具有极高的遗传一致性，种群整体遗传多样性极低，接近近交系物种，其为一个较为纯合的种群。
　　 (4)以林麝、黑麂、梅花鹿和豚鹿等4个物种为外群动物，并基于遗传相似系数矩阵，构建了“北京麋鹿生态实验中心”麋鹿种群所有个体的聚类分析图。在遗传相似系数为0.998810处，种群分为两大类，其中第(Ⅰ)类有181只个体，第(Ⅱ)类有64只个体，并在遗传相似度0.999000水平以上，第(Ⅰ)类和第(Ⅱ)类的每只个体之间的亲缘关系的疏远关系清晰易辨。此外，外群动物与麇鹿的亲缘关系远近为豚鹿>梅花鹿>黑麂>林麝，证实麇鹿与鹿属亲缘关系较近，建议豚鹿可归入鹿属。对遗传相似系数矩阵与聚类树矩阵进行Mental检测，r=0.99882，说明两者极显著相关，所得的聚类树状图具很高的可信度。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一部分 前言

一 保护遗传学概述

1 保护遗传学

2 保护遗传学中常用分子标记

二 AFLP分子标记

1 基本原理

2 主要流程

3 技术特点

4 在动物学研究中的应用

三 麇鹿的研究概述

1 麇鹿的种群历史及发展

2 麇鹿的形态特征和生活习性

3 麇鹿的研究现状

四 本研究的目的及意义

第二部分 材料和方法

一 材料

1 样品

2 主要仪器和设备

3 主要试剂

二 方法

1 基因组DNA的提取

2 AFLP-PCR体系的建立

3 测序仪聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

4 数据处理和分析

第三部分 结果与讨论

一 结 果

1 基因组DNA提取结果

2 PCR-AFLP检测结果

3 北京麋鹿种群的AFLP分析结果v38

二 讨论

1 AFLP的关键技术

2 AFLP分析的高效性

3 外类群物种及麋鹿的亲缘关系

4 基于AFLP构建北京麋鹿种群之亲缘关系图可行性

5 北京麇鹿种群的遗传多样性及生存潜力

6 关于北京麋鹿保护与研究的建议

参考文献