MicroRNAs对家蚕丝蛋白轻链的调控及家蚕14-3-3ξ基因互斥外显子选择机制研究

摘要

MicroRNA是一类内源性小分子单链RNA，长度通常为21-22个核苷酸，通常能够通过与靶基因mRNA的3端非编码区(3UTR)发生碱基配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译，从而起到基因转录后的表达调控作用。MicroRNA通过对其靶基因的调控而发挥功能，所以鉴定其靶基因，对于研究microRNA的生物学功能来说至关重要。
　　 家蚕丝蛋白是一种不溶解性的白色蛋白质，作为原料丝的基本组成部分，具有重要的经济价值。而其中的丝素轻链蛋白又是极其重要的组成部分。之前有研究者通过异源体系鉴定到丝素轻链蛋白可能受到mieroRNA的调控，但是，异源体系鉴定有其局限性，因为植物microRNA与动物microRNA作用途径方式有较大区别，所以我们以家蚕BmN细胞为研究载体，利用绿色荧光蛋白报告基因系统发现miR-190可能对丝蛋白轻链基因起调控作用。对microRNA进行组织特异性表达分析时发现，miR-190相较于其他组织，在后部丝腺中表达量较多，这从另一方面也预示着miR-190极有可能调控着丝轻链蛋白的表达。
　　 为了更好的从蛋白水平研究microRNA对丝蛋白轻链的调控，我们原核表达了丝素轻链蛋白，并且利用此蛋白免疫新西兰兔子，通过ELISA检测及Western印迹检测，都证实了我们得到了效价极高的抗丝素轻链蛋白抗体血清，这也为进一步研究microRNA对丝蛋白的调控打下了扎实的基础。
　　 互斥剪接是选择性剪接的其中一种，后者是基因转录后加工的一个重要调控步骤。互斥剪接包括互斥基因剪接以及互斥外显子剪接，研究的较多的是互斥外显子剪接，也即从一个外显子簇中只选择其中一个外显子进入成熟的mRNA中，从而使得生物体产生蛋白多样性。互斥剪接约占全部剪接事件的10％左右，对其的剪接机制，许多研究者也对此进行了研究探讨，并提出了一些模型予以解释。
　　 14-3-3ζ基因是14-3-3基因家族中的一员，后者广泛存在于真核生物中，是一类重要的调控因子，它能结合多种信号转导相关蛋白，从而起调控作用。本实验从实验室已有的果蝇14-3-3ζ基因研究成果出发，发现了家蚕14-3-3(基因含有一对互斥外显子5a、5b，通过对家蚕在内的八种鳞翅目物种此基因序列分析，发现了两段高度保守的选择序列(SS)和停泊序列(AS)，且它们之间能形成很好的RNA配对二级结构。通过构建野生型mini-gene载体以及一系列的缺失和突变载体，进行实验，表明了此二级结构对5a，5b的互斥表达起到了重要的调控作用，如果这区域的序列能形成良好的二级匹配结构，则5b外显子的表达受抑制，而5a外显子的表达则被激活。反之，则5b外显子的表达被激活。当我们将mini-gene中的外显子5a进行去除时，情况亦然。鉴于此，我们提出了调控家蚕14-3-3ζ基因互斥外显子的机制模型，这也进一步丰富了互斥外显子选择机制的研究。

目录

文摘

英文文摘

致谢

缩略语

第一章 文献综述

1.1 MicroRNA研究进展

1.1.1 简介

1.1.2 MicroRNA的生物发生及沉默机制

1.1.3 靶基因鉴定

1.1.4 MicroRNA表达模式

1.1.5 MicroRNA在动物生长中的调控作用

1.1.6 家蚕microRNA研究进展

1.2 真核生物选择性剪接与互斥剪接研究进展

1.2.1 选择性剪接

1.2.2 选择性剪接的起源和进化

1.2.3 选择性剪接的类型

1.2.4 互斥性剪接

1.2.5 14-3-3基因的研究进展

第二章 实验方案设计

2.1 研究目的及意义

2.2 研究内容

2.2.1 microRNA对家蚕丝蛋白轻链的调控研究

2.2.2 家蚕14-3-3基因互斥外显子选择机制研究

2.3 技术路线

第三章 MicroRNA对家蚕丝蛋白轻链基因的表达调控研究

3.1 材料与试剂

3.2 实验方法

3.2.1 引物设计

3.2.2 预测microRNA与家蚕丝蛋白轻链基因的互作

3.2.3 家蚕后部丝腺RNA的提取

3.2.4 Invitrogen SuperScriptllI l st Strand cDNA synthesis Kit进行逆转录：

3.2.5 PCR扩增

3.2.6 PCR产物的割胶回收（东盛公司的凝胶回收试剂盒）

3.2.7 PCR产物的T载体连接反应

3.2.8 E.coli TG1感受态细胞的制备

3.2.9 连接产物转化感受态细胞

3.2.10 阳性菌落扩大培养及质粒提取

3.2.11 重组质粒酶切鉴定

3.2.12 重组质粒插入片段序列测序

3.2.13 Psk载体的制备

3.2.14 报告基因表达载体及microRNA表达载体共转染家蚕BmN细胞

3.2.15 利用荧光显微镜检测家蚕细胞EGFP发光强度

3.2.16 家蚕不同组织的small RNA提取

3.2.17 Small RNA加poly(A)尾巴

3.2.18 家蚕丝蛋白轻链基因的原核表达

3.2.19 重组fibroin L Chain-6His蛋白纯化回收

3.2.20 融合蛋白透析除尿素复性

3.2.21 融合蛋白浓度测定（考马斯亮兰法Bradford）

3.2.22 融合蛋白免疫新西兰雄兔

3.2.23 抗体的效价测定(ELISA)

3.2.24 Western印迹检测表达的蛋白

3.3 结果与分析

3.3.1 通过软件预测microRNA与家蚕丝蛋白轻链基因的互作

3.3.2 家蚕丝蛋白轻链3'UTR的克隆

3.3.3 报告基因表达载体及microRNA表达载体共转染家蚕BmN细胞荧光分析

3.3.4 microRNA在家蚕各组织中的表达分析

3.3.5 家蚕丝素轻链蛋白的原核表达

3.3.7 Elisa检测抗原血清效价

3.3.8 western印迹检测抗体血清

3.4 讨论

第四章 家蚕14-3-3基因互斥外显子选择机制研究

4.1 材料与试剂

4.2 实验方法

4.2.1 家蚕及其他鳞翅目物种14-3-3基因比较分析

4.2.2 家蚕等物种14-3-3基因其互斥外显子间序列的二级结构预测

4.2.3 引物设计

4.2.4 Genome DNA提取

4.2.5 RT-PCR，酶切检测各突变表达载体转染后其互斥外显子5a,5b含量

4.3 结果分析

4.3.1 家蚕及其他鳞翅目物种14-3-3基因互斥外显子分析

4.3.2 以家蚕为研究对象，研究内含子间二级结构对互斥选择的调控影响

4.3.3 家蚕各组织及发育阶段14-3-3基因表达分析

4.4 讨论分析

参考文献

个人简历