稻瘟病菌含LXAR序列元件效应分子的克隆和功能分析及稻瘟菌无毒基因的分子标记

摘要

稻瘟病是一种由稻瘟病菌引起的的毁灭性病害,给全世界的水稻生产和安全带来了巨大威胁。稻瘟病菌在侵染水稻时,通过特殊机制将稻瘟病菌效应分子转运至水稻细胞内,从而干扰和抑制水稻的免疫抗性反应,实现对水稻的成功侵染。通过生物信息学分析和烟草接种实验发现了17个含有LXAR序列元件的效应分子基因能够非常显著地抑制BAX诱导的细胞死亡,对这些基因进行鉴定和功能研究对于明确稻瘟病菌与水稻互作的分子机制有重大意义。本研究主要分为以下四个方面:
　　 1过表达载体的构建和稻瘟病菌转化通过酶切连接反应将目的基因克隆到过表达载体的上,然后转化到稻瘟病菌Guyl1原生质体中得到过表达突变体。构建了17个含有LXAR序列元件的效应分子基因过表达载体,并转入稻瘟病菌Guyl1中。
　　 2稻瘟病菌含有LXAR序列元件的效应分子基因编码区序列和启动子区序列的多态性分析搜集60个国内和国际不同地区的稻瘟病菌代表菌株,分析菌株的生物学性状,最后确定了11个不同地理分布,不同致病性的菌株。同时,从17个含有LCAR序列元件的效应分子基因当中选取10个扩增效率高、代表性强的基因作为研究对象进行序列多态性分析。结果发现编码区序列未发现明显的多态性,但启动子区转座因子则表现显著地多态性,说明效应分子面临正向选择压力。
　　 3部分含有LXAR序列元件的效应分子基因敲除及突变体菌株性状分析完成了5个标基因(P1_3119,P2_2484,P1_2310,P2_6480,P2_3959)敲除载体的构建,其中2个基因(P1_3119,P2_2484)已经得到敲除突变体。与野生菌株Guyl1比较,过表达P2_2484的突变体生长速度略有加快,并且孢子存在一定的畸形现象,而P2_2484敲除突变体则差异不明显,表明P2_2484很可能是与生长相关的微效基因。P1_3119敲除突变体和过表达突变体在菌落形态、生长速度、孢子萌发以及致病性上无明显差异。
　　 4稻瘟病菌AvrPiSH-S基因的分子标记利用传统的图位克隆方法对稻瘟病菌株P131和S1528杂交后代进行无毒基因分子标记。首先,筛选得至B水稻近等基因系IRBLSH-S品种对P131和S1528存在致病性差异,推测S1528含有AvrPiSH-S无毒基因。其次,以鉴别得到水稻近等基因系IRBLSH-S为测试品种,完成了97个后代子囊孢子进行致病性测定,分离比率大致为1:1,说明S1528是单个无毒基因控制的。然后从75对PATE标记引物对中筛选得到了P7引物对S1528、抗池、两个随机抗性菌株和P131、感池、两个随机毒性菌株扩增得到一个大小约为800bp的特异性片段,该片段很可能是与无毒基因相连锁的。

目录

文摘

英文文摘

致谢

第一章 文献综述

1.稻瘟病概述

1.1 稻瘟病及病原病菌

1.2 稻瘟病的侵染循环

2.稻瘟病菌效应分子和无毒基因的研究进展

2.1 稻瘟病菌效应分子和无毒基因

2.2 已鉴定和克隆的稻瘟病菌无毒基因

2.3 稻瘟病菌无毒基因克隆方法

3.稻瘟病菌无毒基因图位克隆

3.1 建立一个能够区分无毒基因有无的遗传分离群体

3.2 寻找与无毒基因紧密连锁的分子标记

3.3 构建含有较大插入片段的基因组文库

3.4 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置

3.5 构建重叠克隆群

3.6 染色体步移、登陆

3.7 目标基因的鉴定

4.稻瘟病菌无毒基因的分子标记与定位

5.本研究的目的内容和技术路线

第二章 材料与方法

1.实验材料

1.1 实验菌株

1.2 质粒载体

1.3 水稻、大麦致病性测定品种

1.4 各类培养基、抗生素及工具酶

1.5 各类生化试剂、溶液及试剂盒

2 稻瘟病菌生物学性状测定试验

2.1 菌落生长速度及菌落特性

2.2 稻瘟病菌产孢培养和产孢量

2.3 附着胞形成实验

2.4 稻瘟病菌有性生殖实验

2.5 稻瘟病菌单孢分离实验

2.6 大麦和水稻离体接种

2.7 洋葱表皮穿透实验

2.8 稻瘟病菌菌丝、分生孢子和附着孢的GFP观察

3 各类PCR反应

3.1 常规PCR反应体系

3.2 细菌菌落PCR反应体系

4.质粒DNA、基因组DNA及小片段DNA相关操作

4.1 质粒DNA提取

4.2 基因组DNA抽提

4.3 DNA酶切

4.4 胶回收

4.5 酶切DNA片段的去磷酸化

4.6 连接反应

5.细菌和真菌转化

5.1 大肠杆菌感受态细胞制备及细菌转化

5.2 稻瘟病菌原生质体制备与转化

第三章 结果与分析

1.稻瘟病菌效应分子基因对BAX诱导的细胞死亡的抑制作用的分析

2.目的基因过表达载体的构建和转基因稻瘟病菌菌株的制备

2.1 目的基因过表达载体的构建

2.2 目的基因转过表达稻瘟病菌菌株的制备

3.效应分子基因编码序列和启动子序列的多态性分析

3.1 Pot3转座子的多态性分析

3.2 目的基因编码区序列多态性

3.3 目的基因启动子区序列多态

3.4 Pot3转座子功能验证

4.P2_2484基因敲除及突变体菌株性状

4.1 P2_2484基因敲除载体构建

4.2 P2_2484突变体的获得

4.3 P2_2484敲除突变体和过表达突变体的性状比较分析

5.P1_3119基因敲除及突变体菌株性状

5.1 P1_3119基因敲除载体构建

5.2 P1_3119突变体的获得

5.3 P1_3119敲除突变体和过表达突变体的性状分析

6.稻瘟病菌株P131和S1528杂交后代无毒基因分子标记

6.1 P131和S1528有性杂交和后代子囊孢子的分离

6.2 筛选对亲本P131和S1528致病性差异的水稻品种

6.3 水稻致病性测定条件的优化

6.4 P131和S1528有性杂交后代子囊孢子的致病性测定

6.5 P131和S1528有性杂交后代子囊孢子的抗池和感池的鉴定

6.6 筛选对亲本P131和S1528致病性差异的PATE引物

6.7 无毒菌株特异片段的克隆、鉴定及测序

第四章 全文总结讨论及后续研究

1.全文总结讨论

2.存在的问题和今后的研究

参考文献

附表:论文中的引物信息