稻水象甲共生菌Wolbachia的多位点序列分型及对寄主生殖的影响

摘要

Wolbachia是一类革兰氏阴性内共生菌,能对宿主生物学产生许多影响,其中主要是对宿主的生殖进行调控,包括引起细胞质不亲和、孤雌生殖、雌性化、杀雄等。稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)是我国的一种检疫性害虫。其在北美原产地主营两性生殖,而在各入侵地均营孤雌生殖。之前的研究在稻水象甲中检测到了Wolbachia,但其检测主要基于wsp和16s rDNA等单基因分析,结果缺乏可靠性。本研究首次采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MIST)的方法对不同地理种群的稻水象甲中Wolbachia进行分析,并研究了抗生素处理对孤雌生殖稻水象甲产生的影响,结果如下:
　　 对国内7个地理种群和美国德州地理种群的共103头稻水象甲成虫的DNA样本进行wsp基因检测,结果在所有样本中均扩增到了wsp基因,表明所有种群均被Wolbachia感染,且各种群的个体感染率均高达100％。各种群均仅为单菌株感染。而且,国内不同地理种群中扩增到的5个MLST基因(ftsZ,gatB,coxA,hcpA,fbpA)序列完全均一致,但它们与美国德州种群中的Wolbachia相应序列有较大差异。系统发育分析表明,国内稻水象甲(入侵种群,孤雌生殖型)和美国稻水象甲(原产地种群,两性生殖型)中的Wolbachia处在明显不同的聚类簇中,两者株系明显不同。
　　 经四环素处理后,稻水象甲(孤雌生殖型)的产卵量显著少于水处理和庆大霉素处理中的成虫,且所产卵均不能正常孵化。而对照庆大霉素和水处理中的卵则大多可以正常孵化,且两处理间无显著差异。表明经四环素处理去除Wolbachia后,稻水象甲的生殖受到严重抑制,推测该共生菌在稻水象甲卵的发育过程中起着十分关键的作用。
　　 本研究丰富了对象甲类昆虫中Wolbachia感染情况及对寄主生殖影响的认识,也为今后进一步研究稻水象甲与Wolbachia的关系积累了基础信息。

目录

文摘

英文文摘

致谢

1.选题依据

1.1 Wolbachia的研究概况

1.1.1 Wolbachia的传播和基因水平传递

1.1.2 Wolbachia的多重感染和重组

1.1.3 Wolbachia的检测和系统发育分析

1.1.4 Wolbachia对宿主的生殖调控作用

1.1.5 抗生素处理昆虫体内Wolbachia

1.2 稻水象甲

1.2.1 稻水象甲的生殖方式

1.2.2 稻水象甲中Wolbachia的研究

1.3 本研究的目的与意义

2.材料与方法

2.1 供试虫源

2.2 仪器和试剂

2.2.1 主要实验仪器

2.2.2 主要实验试剂

2.3 稻水象甲基因片段的克隆与序列测定

2.3.1 稻水象甲基因组DNA的提取

2.3.2 目的DNA片段的扩增

2.3.3 PCR产物回收纯化

2.3.4 质粒载体的连接反应和转化

2.3.5 重组阳性克隆的鉴定

2.3.6 DNA序列的测定和分析

2.3.7 进化和系统发育分析

2.4 稻水象甲中Wolbachia对宿主生殖的影响

2.4.1 供试虫源

2.4.2 实验材料

2.4.3 实验方法

3.结果分析

3.1 各地理种群稻水象甲感染Wolbachia的情况

3.2 基于MLST5个基因的Wolbachia系统发育分析

3.2.1 采用ClonalFrame软件分析结果

3.2.2 采用PAUP软件分析结果

3.3 抗生素处理后对稻水象甲生殖的影响

4.讨论

4.1 稻水象甲中Wolbachia的高感染率和单株感染

4.2 两种生殖型稻水象甲均被Wolbachia感染

4.3 不同生殖型稻水象甲感染的Wolbachia差异大

4.4 抗生素处理抑制孤雌生殖稻水象甲卵的孵化

参考文献