宫内感染/炎症后未成熟脑星形细胞胶质化的作用及机制研究

摘要

脑白质损伤(White matter damage,WMD)是早产儿最重要的脑损伤,其病理特点主要是脑白质损伤部位出现反应性星形细胞胶质化、小胶质细胞浸润、少突胶质细胞损伤和髓鞘损害以及轴突损伤等。宫内感染／炎症、早产和早产儿脑白质密切相关,而且神经胶质细胞和炎症信号在宫内感染／炎症导致的脑损伤中起重要作用。宫内感染后脑内炎症反应影响未成熟星形细胞的增殖和胶质化是脑白质损伤的关键之一,Toll-like受体-4(TLR-4)／核因子κB(NF-κB)信号和Notchl／Hes信号可能参与宫内感染／炎症后未成熟星形细胞的增殖和胶质化机制。本研究通过建立宫内感染的大鼠模型,研究宫内感染／炎症后未成熟脑星形细胞增殖和胶质化的时空性；以及通过星形细胞培养,研究感染／炎症对未成熟星形细胞增殖和胶质化的影响和TLR-4／NF-κB及Notchl／Hes信号是否参与这一过程；而且予茶多酚(TP-EGCG)干预,探讨TP-EGCG对感染／炎症后未成熟星形细胞增殖和胶质化行为的作用及是否影响星形细胞TLR-4／NF-κB及Notchl／Hes信号等,从炎症和发育信号角度进一步说明宫内感染／炎症后未成熟星形细胞的损伤机制,为将来防治早产儿脑白质损伤提供理论依据。
　　 目的:
　　 研究宫内感染／炎症后不同时间脑内不同部位(脑室旁白质、海马、胼胝体和皮层)星形细胞的增殖特点,探讨感染／炎症对未成熟星形细胞增殖和胶质化的影响以及TLR-4、NF-κBp65和细胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β等)的表达特点以及Notch1信号的表达变化,研究TP-EGCG对感染／炎症后未成熟星形细胞增殖和胶质化行为的作用及这一作用是否影响炎症信号及Notch1信号。
　　 方法:
　　 1.动物模型:官内感染组孕15天母鼠宫颈左右两侧各注射大肠杆菌稀释液0.2 mL,对照组注入等量生理盐水。取新生1、3、7、14、21日龄大鼠脑组织,测定各时点仔鼠体重、脑重,苏木素-伊红(HE)染色和免疫组化方法研究新生1、3、7、14、21日龄大鼠脑白质组织病理特点和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化。
　　 2.星形细胞培养:不同浓度脂多糖(LPS:1μg／mL、5μg／mL、10μg／mL)刺激不同时间(1、3、7天)后,免疫荧光法检测星形细胞GFAP+／BrdU+的表达变化,观察星形细胞增殖活性的变化,ELISA法检测星形细胞培养液细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-10等)浓度变化,同时荧光定量RT-PCR法检测LPS刺激后星形细胞TLR-4、NF-κB以及细胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β)mRNA的表达变化,以及Notch1、Hes1、Hes5 mRNA的表达变化。
　　 3.TP-EGCG干预:以LPS(5μg／mL)刺激1天和3天,同时予TP-EGCG干预后,免疫荧光法检测GFAP+／BrdU+表达变化；以及荧光定量RT-PCR法检测星形细胞TLR-4、NF-κB以及细胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β)mRNA的表达变化和Notch1、Hes1、Hes5 mRNA的表达变化。
　　 结果:
　　 1.宫内感染组子宫及胎盘内血管充血、水肿,并见大量中性粒细胞浸润,宫内感染组新生1日龄(P1)仔鼠体重和脑重均较同日龄对照组减轻(P<0.05)。宫内感染组与对照组P1和P3大鼠仅脑室旁脑白质区可见少许GFAP阳性细胞,两组比较差异无显著意义(P>0.05)；官内感染组P7大鼠脑室旁白质区和海马区GFAP阳性细胞胞浆明显、突起增多,细胞数量多于对照组(P<0.05)；官内感染组P14大鼠脑室旁白质、肼胝体和皮层区GFAP阳性细胞数量多于对照组(P<0.01)；两组P21大鼠各脑区GFAP阳性细胞数均无显著差异(P>0.05)。
　　 2.LPS(10μg／mL)刺激早期GFAP+／BrdU+细胞数与对照组比较减少(P<0.05),而LPS(5μg／mL)刺激后GFAP+／BrdU+细胞数较对照组增加(P<0.05)。LPS(5μg／mL)刺激早期星形细胞培养液TNF-α、IL-1β浓度较对照组升高明显(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激1天时星形细胞TLR-4 mRNA表达较对照组降低明显(P<0.05),而LPS(5μg／mL)刺激3天时星形细胞TLR-4 mRNA表达升高(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激3天时星形细胞NF-κBp65 mRNA表达减少(P<0.05),而LPS(5μg／mL和10μg／mL)刺激7天时NF-κBp65 mRNA表达均较对照组升高(P<0.05)。LPS(1μg／mL)刺激后星形细胞Notch1 mRNA表达较对照组下降(P<0.05),但LPS(10μg／mL)刺激1天、LPS(5μg／mL)刺激7天时Notch1 mRNA表达升高(P<0.05)。LPS(10μg／mL)刺激1天、LPS(1μg／mL)刺激7天时Hes1 mRNA表达减少(P<0.05),而LPS(1μg／mL)刺激早期星形细胞Hes5 mRNA表达增加与对照组比较有明显差异(P<0.05)。
　　 3.予TP-EGCG干预后星形细胞GFAP+／BrdU+细胞数较LPS组下降(P<0.05),且与对照组比较差异不明显(P>0.05)。LPS组与LPS+EGCG组比较星形细胞TLR-4mRNA表达差异无意义(P>0.05),但两组比较星形细胞NF-κBp65 mRNA表达减少均差异有意义(P<0.05),而两组比较星形细胞TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β mRNA表达差异均无意义(P>0.05)。LPS组与LPS+EGCG组星形细胞Notch1、Hes1 mRNA表达差异有意义(P<0.05),但两组比较星形细胞Hes5 mRNA表达差异无意义(P>0.05)。
　　 结论:
　　 1.官内感染／炎症后未成熟脑不同脑区不同日龄的GFAP表达呈一定的时空性,表明宫内感染／炎症可能改变未成熟脑星形细胞的功能。
　　 2.不同的感染／炎症条件下对未成熟星形细胞的增殖活性影响是不同的,LPS刺激后星形细胞细胞因子(TNF-α、IL-1β、MIP-1α、MIP-1β、IL-10等)存在短暂的表达增加现象,且不同的感染／炎症条件下TLR-4／NF-κB及Notch1／Hes信号的表达特点是不同的。
　　 3.TP-EGCG对LPS刺激3天后的星形细胞增殖能力有一定的改变,但对TLR-4 mRNA及细胞因子的表达变化影响不明显,TP-EGCG对感染／炎症时星形细胞NF-κBp65 mRNA表达抑制有改善作用,而且TP-EGCG对感染／炎症条件下星形细胞的Notch1、Hes1 mRNA的表达减少有影响。