重组大肠杆菌高效生产嘌呤核苷磷酸化酶和L-色氨酸的研究

摘要

嘌呤核苷磷酸化酶是嘌呤核苷补救代谢途径中的关键酶，在抗肿瘤基因治疗、核苷类药物合成等方面具有广泛的应用。L-色氨酸是人体八种必需氨基酸之一，在医药、食品添加剂、饲料等方面具有重要的市场发展前景.
　　 本文开展了在重组大肠杆菌中如何实现高效生产嘌呤核苷磷酸化酶和L-色氨酸的系统研究。
　　 首先构建了高效表达嘌呤核苷磷酸化酶基因的表达载体，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中，构建了能够表达嘌呤核苷磷酸化酶的重组大肠杆菌。通过优化重组细胞的表达和诱导条件，实现了嘌呤核苷磷酸化酶的高效可溶性表达，最高表达水平达到196U/mL。进一步研究了重组酶的底物特异性，发现与非重组嘌呤核苷磷酸化酶的特性基本一致，并发现琼脂是一种较合适的固定化载体，开展了游离细胞和固定化细胞的酶学特性比较、反应动力学和稳定性研究。结果表明，细胞的固定化降低了重组细胞对底物的亲和力和催化效率，却显著提高其稳定性和反复使用性。固定化细胞催化的反应在较低底物浓度下由于扩散限制偏离了米氏方程规律，但在高浓度条件下依然遵守米氏方程规律，而游离细胞催化的反应均完全遵从米氏方程。以合成利巴韦林为例，开展了固定化重组细胞催化合成核苷类药物的研究．通过优化游离细胞合成利巴韦林的多个反应条件，催化反应的转化效率达到了80.8％．当采用固定化细胞合成利巴韦林时，在添加18.8g/L固定化细胞的条件下，经过4小时反应，利巴韦林的转化率尽管有所下降(70.2%)，但可以反复使用，经过连续10次反应，利巴韦林的转化率没有明显降低。
　　 其次开展了重组大肠杆菌高产L-色氨酸的发酵工程研究。基于构建的大肠杆菌代谢工程菌，首先优化了种子培养基、发酵培养基及多种发酵条件。在此基础上，开展了间歇和流加发酵研究，结果表明，在间歇发酵条件下磷酸盐添加对L-色氨酸发酵影响较大，确定了流加发酵时磷酸盐的添加量以20g/L为最佳．葡萄糖指数流加方式能够明显提高发酵产率，最大的产物浓度和发酵产率分别达到10.6g/L和0.45g/(L·h)。进一步采用底物反馈流加方式能够维持发酵液中较低的葡萄糖浓度，L-色氨酸的产量提高到25.5g/L。最后提出了一种新型的指数流加策略，L-色氨酸产量和平均产率分别提高到24.9g/L和0.58g/(L·h)的较高水平。
　　 随后系统考察了各种添加剂对L-色氨酸发酵的影响，结果表明非离子型表面活性剂能有效促进L-色氨酸累积，而抗生素和阳离子表面活性剂效果不明显。分别添加吐温60和聚醚L61进行间歇和流加发酵，L-色氨酸产量分别达到了32.3和35.5g/L．进一步采用代谢工程技术，通过估算L-色氨酸生物合成途径的代谢流量分布，发现吐温60和聚醚L61引起了流量分布的明显变化，导致L-色氨酸合成流量的显著增加．开发了一条从发酵液中分离纯化L-色氨酸的工艺路线。研究了强酸型阳离子树脂吸附分离L-色氨酸的单元操作，建立了L-色氨酸吸附等温线模型及吸附动力学和热力学分析，形成了高效的柱层析分离纯化工艺。在此吸附分离工艺条件下，并结合其他分离操作的优化，L-色氨酸总收率达到68.8%，产品纯度达到97.5%．
　　 总之，通过本论文的系统研究，实现了重组大肠杆菌高产两种不同类型的发酵产物，为嘌呤核苷磷酸化酶和L-色氨酸的工业化生产奠定了良好基础。