白菜花粉多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF16和BcMF17的分离与鉴定

摘要

本研究以拟南芥数据库作为依托,分析拟南芥花粉发育相关的12个多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因,作为后续研究的参照。以白菜花粉发育相关PG基因BcMF16和BcMF17基因为研究对象,通过PCR扩增方法对白菜BcMF16和BcMF17基因的基因组全长和cDNA全长进行了克隆、鉴定以及蛋白质结构和功能的预测:利用RT-PCR和原位杂交方法对BcMF16和BcMF17基因表达模式进行了探究；通过构建其反义RNA载体,对菜心[B.campestris L.ssp.chinensis Markino vat.parachinensis(Bailey)Tsen et Lee]进行转化,以获得这两个基因功能缺失突变体,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能；并比较了白菜中分离鉴定的5个PG基因的功能差异。研究结果如下:
　　 (1)通过大量数据库中基因数据的分析,找到了12条与拟南芥花粉发育相关的PG基因。这12条PG基因拟南芥花粉发育相关PG基因都以串联重复方式排列在染色体上,有5条集中在第3条染色体上。除4条拟南芥花粉发育相关PG基因可被归为“花粉早期”基因,其余8条均可被归为“花粉晚期”基因。
　　 (2)从白菜‘矮脚黄’核隐性不育两用系的可育株系中成功克隆了花粉发育特异的PG基因BcMF16的DNA全长序列和cDNA序列。BcMF16包含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为1431bp,编码476个氨基酸序列。从PG基因的系统进化树中,发现BcMF16属于花粉中特异表达的外切PG类。RT-PCR和原位杂交结果显示,BcMF16在可育株系三级花蕾的绒毡层与配子体中开始表达,并随着花粉发育,表达量不断增加。
　　 (3)从白菜‘矮脚黄’核隐性不育两用系的可育株系中成功克隆了花粉发育相关的PG基因BcMF17的DNA全长和cDNA序列。BcMF17具有4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为1194个碱基,编码397个氨基酸,编码的假定蛋白质的分子量为42.361KDa,等电点为7.379。从PG基因的系统进化树中,发现BcMFl7位于双子叶植物花粉PG大类。RT-PCR结果显示。BcMF17为一组成型表达型的基因,在不育株系与可育株系的所有组织和发育时期均可检测到该基因的转录本,但是在花粉发育的后期该基因的mRNA积累量较多。原位杂交结果显示BcMF17在整个花药中均有表达,但是在花粉与绒毡层中的表达量较高,尤其是在成熟花粉粒中的表达量最高。
　　 (4)通过反义RNA技术,定向抑制BcMF16的表达,以分析其在花粉发育过程中的作用。发现BcMF16在雄配子体中具有较重要的作用,不仅能够影响四分体的分离,且能影响花粉内壁的建成。但是当BcMF16受到抑制时,花粉外壁的形成并不受到影响。通过RT-PCR检测其他花粉PG表达时,发现其他花粉发育相关的PG基因的表达不受BcMF16受到抑制的影响。所以BcMF16可能是在这些基因起作用之后才表达的。
　　 (5)通过以BcA9启动子启动BcMF17特异的反义片段,定向抑制BcMF17在花药发育过程中的表达。将pBI-BcA9∷bcmf17载体导入菜心后,获得了BcMF17表达几乎受到沉默的转基因芽系。在转基因芽系中,检测不到BcMF16、BcMF9、BcMF6和BcMF2的表达,推测BcMF17的表达在这些基因之前,且能够间接的调控这几个基因的表达。BcA9∷bcmf17表现出绒毡层细胞的提前降解,且花粉粒也在后期被降解。BcMF17通过调节细胞体内的pH值而间接调节了Ca+的浓度,从而打乱了绒毡层细胞的PCD过程,同时也诱导了花粉粒降解过程。