生物人工肝/肾的微型化及其对药物清除率的预测

摘要

药物在生物体内的基本行为可分为吸收(A)、分布(D)、代谢(M)与排泄(E)四个过程，它们由不同的器官承担，并决定了药物的治疗效果与毒副作用。因此，制药公司往往采用模拟各器官功能的体外模型分别对候选药物ADME进行评价，以快速和早期地判断其开发潜力。由于药物的代谢与排泄（合称为清除）主要发生于肝脏与肾脏，肝/肾体外模型也被广泛用于药物清除速率（清除率）的预测，然而常用的肝/肾模型功能偏离体内，难以准确预测药物清除率。因此，本论文拟首先优化实验室已有的微型生物人工肝，并进一步构建微型生物人工肾，考察微型生物人工肝/肾反映体内肝/肾功能及其对药物清除率的预测准确度，评价其作为药物清除研究新模型的可行性。
　　在前期研究中，本实验室将原代大鼠肝细胞凝胶包埋于中空纤维膜内，构建了微型生物人工肝，且证明其可长期维持体内Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶活性。本文进一步对微型生物人工肝进行培养条件优化，并考察其反映体内Ⅲ相代谢（即转运蛋白介导的肝胆转运）的能力。在优化培养条件（胶原浓度0.6 g/L，并加入表皮细胞生长因子EGF）下，微型生物人工肝经5d培养后重建体内极性，且具有较传统三明治培养模型更高的转运蛋白水平和药物胆汁清除率预测准确度。此外，它能够反映转运蛋白对甲氨蝶呤及红霉素肝毒性的抑制作用。这些说明微型生物人工肝能较高水平地表达体内Ⅲ相代谢酶，预示其可以较好地预测药物肝清除率。
　　随后，我们将大鼠肾近端小管细胞（RPTC）、人肾近端小管细胞系(HK-2)和犬肾远端小管细胞系(MDCK)分别贴壁培养于中空纤维膜内腔，使其经7d培养后形成融合单层，从而构建了微型生物人工肾。与传统单层贴壁培养模型相比，微型生物人工肾的线粒体活性及谷胱甘肽含量略低，但表征分化功能的细胞色素P4503A、多药耐药相关蛋白2及刷状缘膜蛋白活性却高得多，尤其是刷状缘膜蛋白的活性更接近于体内肾脏水平。同样，肾功能的较好表达为预测药物肾清除率提供了必要前提。
　　最后，我们采用微型人工肝/肾预测一系列药物的体内清除率，发现对于肝清除率（20种药物）、肾清除率（14种药物）及整体清除率（8种药物），微型生物人工肝/肾的预测准确度（关联系数R2分别为0.92、0.76和0.94）均优于文献报道结果（R2分别为0.8、0.6及0.6左右）。
　　总之，相对于传统模型，微型人工肝/肾能够较好地维持体内肝/肾功能且较准确预测药物清除率，因而可进一步应用到新药开发中。此外，该中空纤维型反应器也为体外构建多器官细胞模型奠定了基础。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

前言

第1章 文献综述

1．1 药物体内行为与肝／肾清除

1．1．1 肝脏与药物肝清除

1．1．2 肾脏与药物肾清除

1．1．3 药物代谢动力学与清除率

1．2 体外药物清除率预测的研究进展

1．2．1 用于肝清除率与胆汁清除率预测的体外模型

1．2．2 用于肾清除率预测的体外模型

1．2．3 用于整体清除率预测的体外模型

1．2．4 体外模型预测清除率及其影响因素

1．3 生物人工肝／肾及其微型化

1．3．1 常见生物人工肝构型及其微型化

1．3．2 常见生物人工肾构型

1．4 课题的主要研究思路

第2章 材料与方法

2．1 动物与细胞株

2．2 主要试剂与仪器

2．2．1 主要试剂

2．2．2 仪器设备

2．3 大鼠肝细胞分离与培养

2．3．1 大鼠肝细胞分离

2．3．2 肝细胞单层贴壁培养

2．3．3 肝细胞三明治培养

2．3．4 微型生物人工肝制备

2．3．5 药物对肝细胞的毒性作用

2．4 体外肝细胞功能分析

2．4．1 细胞活率(MTT法)测定

2．4．2 细胞转运蛋白活性测定

2．4．3 胆汁清除率预测

2．4．4 RT-PCR检测

2．4．5 透射电镜检测

2．4．6 转运蛋白抑制对药物胞内积累的影响

2．5 肾细胞分离与培养

2．5．1 大鼠肾近端小管上皮细胞分离

2．5．2 肾小管细胞单层贴壁培养及传代

2．5．3 微型生物人工肾的制备

2．6 体外肾小管功能分析

2．6．1 扫描电镜观察

2．6．2 渗透率检测

2．6．3 细胞生长速率检测

2．6．4 线粒体活性及谷胱甘肽(GSH)水平测定

2．6．5 碱性磷酸酶(AP)活性测定

2．6．6 γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性测定

2．6．7 葡萄糖转运蛋白(GLUT)活性及葡萄糖重吸收速率测定

2．6．8 CYP3A活性测定及其抑制

2．6．9 Mrp2及Mdr1活性测定

2．6．10 RT-PCR检测

2．7 清除率预测

2．7．1 大鼠肝细胞药物处理及取样

2．7．2 肾小管上皮细胞药物处理及取样

2．7．3 样品检测

2．7．4 数据分析

2．7．5 预测精确度评价

2．8 统计学分析

第3章 微型生物人工肝的的肝胆转运功能研究

3．1 引言

3．2 基于肝胆转运功能的微型生物人工肝培养条件改进

3．2．1 胶原浓度对细胞肝胆转运功能的影响

3．2．2 培养基添加成分对细胞肝胆转运功能的影响

3．3 转运蛋白活性与基因表达评价

3．4 本章小结

第4章 微型生物人工肝预测胆汁清除率及肝胆转运相关毒性

4．1 引言

4．2 微型生物人工肝预测胆汁清除率

4．2．1 用于胆汁清除率预测的细胞培养时间和化合物选择

4．2．2 肝细胞对体内胆汁清除率的预测

4．3 微型生物人工肝用于肝胆转运相关药物毒性研究

4．3．1 微型生物人工肝用于甲氨蝶呤毒性研究

4．3．2 微型生物人工肝用于红霉素毒性研究

4．4 本章小结

第5章 微型生物人工肾的构建及其功能研究

5．1 引言

5．2 用于微型生物人工肾的包被基质筛选

5．3 微型生物人工肾内的细胞融合

5．4 体外肾小管细胞的生长及功能评价

5．4 原代大鼠肾小管细胞体内外功能对比

5．5 本章小结

第6章 微型生物人工肝／肾预测药物清除率

6．1 引言

6．2 微型生物人工肝预测药物肝清除率

6．2．1 微型生物人工肝的药物清除

6．2．2 微型生物人工肝对体内肝清除率的预测

6．3 微型生物人工肾预测肾清除率

6．3．1 微型生物人工肾对主动运输型药物的清除率预测

6．3．2 微型生物人工肾反映药物被动重吸收的能力

6．4 整体清除率预测

6．5 本章小结

第7章 结论与展望

7．1 总结

7．2 不足之处

7．3 展望

论文主要创新点

参考文献

攻读学位期间的科研成果