EGCG在血清剥夺条件下诱导溶酶体依赖而非自噬依赖的细胞死亡

摘要

[研究目的]
　　 EGCG是绿茶茶叶中含量最多、活性最高的儿茶素，也是研究最广泛最深入的茶多酚类物质。目前对EGCG的体外研究认为，EGCG能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。但问题在于细胞培养体系中EGCG引起细胞死亡的有效浓度通常需要达到200μM，甚至更高，而由于EGCG的吸收限制和代谢迅速，实际情况很难达到如此高的血药浓度。因此，如何在保证EGCG细胞毒性的同时降低其有效浓度是一个亟待解决的问题。我们的研究发现，剥夺培养体系中的血清成分能显著增加低剂量情况下EGCG的细胞毒性。为此，我们希望能进一步探究无血清条件造成EGCG细胞毒性增强的分子机制。
　　 [研究方法]
　　 1.细胞培养：细胞分别在完全或无血清培养液中预处理1小时，随后加入EGCG处理不同时间；
　　 2.Hoechst-PI双染检测细胞存活率：hoechst标记总细胞，PI标记死细胞，利用软件ImageJ计数细胞；
　　 3.Westernblotting实验：提取细胞总蛋白或利用digitonin分离包浆蛋白，检测不同蛋白在细胞内的表达；
　　 4.细胞染色：吖啶橙染色，油红O染色，Lyso-TrackerRed探针标记，ROS探针标记，magicred标记；
　　 5.免疫荧光染色：溶酶体膜蛋白LAMP-1及内质网膜蛋白Bip染色。
　　 [研究结果]
　　 1.剥夺培养体系中的血清成分能显著增加低剂量情况下EGCG的细胞毒性。并且在无血清体系中，EGCG引起的细胞死亡是一种以胞浆空泡化为主要特征，且有别于凋亡的caspase非依赖性细胞死亡形式。
　　 2.在这一过程中虽然能够观察到自噬体的显著增加，但最后的细胞死亡却是自噬非依赖的。事实上，EGCG在无血清体系中引起溶酶体膜通透(LMP)，导致胞浆酸化及溶酶体内蛋白酶向胞浆渗漏，是引发细胞死亡的主要原因。而溶酶体损伤引起溶酶体本身pH升高、蛋白酶活性下降，使溶酶体丧失降解功能才是导致自噬体堆积的直接原因。
　　 3.胞浆空泡是由于溶酶体胀大所产生的。
　　 4.溶酶体膜之所以发生损伤可能是EGCG在无血清体系中诱导大量ROS形成所造成的。
　　 [研究结论]
　　 血清剥夺造成EGCG的细胞毒性增强与ROS介导的溶酶体不稳定密切相关。