CDK2泛素化降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中的作用研究

摘要

研究目的:
　　 急性髓性白血病(acutemyeloidleukemia,AML)的重要标志为严重的髓系分化障碍,因此诱导分化治疗是目前公认的针对AML的有效治疗策略。利用全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)治疗早幼粒细胞白血病(acutepromyeloidleukemia,APL,M3型AML)是诱导分化治疗策略用于临床实践的最成功范例。由于ATRA在临床应用上的巨大成功,深入研究ATRA诱导细胞分化的分子机制,进一步发现诱导分化治疗的潜在靶标,完善诱导分化治疗策略是许多肿瘤学家追求的重要目标。
　　 现代分子生物学研究发现ATRA诱导白血病细胞分化过程中往往伴随有细胞退出增殖周期,即细胞周期阻滞于G0/G1期。因此细胞周期调控因子在ATRA诱导分化中的作用成为该领域的研究热点之一。根据现有文献报道,细胞周期蛋白依赖激酶活化激酶(Cyclin-dependentkinase-activatingkinase,CAK)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21WAF1/Cip-1、p27Kipl和CyclinE等都被认为在ATRA诱导细胞分化过程中发挥重要作用.但细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin-dependentkinases,CDKs)是否在该过程中发挥作用目前仍无文献报道。
　　 细胞周期蛋白依赖激酶2(Cyclin-dependentkinase2,CDK2)属于CDK丝氨酸/苏氨酸激酶家族,是细胞G1/S期转换过程中的重要调控因子。CDK2可分别结合于CyclinE和CyclinA,随后CAK磷酸化其苏氨酸160位(Thr-160)而被激活,通过磷酸化众多底物而促进G1/S期的进程。然而除在细胞周期中发挥重要作用外,近年来CDK2也被发现在调控细胞自我更新和分化中起到关键作用。一些文献报道CDK2活性或表达可促进鼠神经母细胞瘤细胞、胚胎干细胞、小鼠中枢神经系统祖细胞和成年小鼠的髓鞘等的分化。
　　 泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)是真核细胞内蛋白质选择性降解的重要途径。通过选择性降解并调控细胞内蛋白,UPS广泛地参与细胞的生长、分化、凋亡、周期调控、炎症反应等重要的生命活动过程。本课题组前期研究发现,ATRA诱导AML细胞分化和G0/G1周期阻滞的过程中伴随有CDK2蛋白水平的明显下降,而同时抑制蛋白酶体活性,CDK2下调的趋势被明显逆转,提示CDK2在ATRA作用后可能通过UPS发生降解。关于CDK2的降解机制及其在ATRA诱导细胞分化中的作用目前均尚无文献报道。
　　 因此,本课题的研究将分两部分探讨ATRA诱导AML细胞分化中UPS介导的CDK2的降解:1)确证ATRA促进CDK2通过UPS发生降解,并探讨其调控机制;2)研究CDK2降解对ATRA诱导AML细胞分化的影响,并探索相关分子机制。研究方法:
　　 1)选用人白血病细胞株NB4和U937为主要研究对象,考察ATRA诱导细胞分化过程中CDK2泛素化降解的情况:细胞经CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达;应用瑞氏.吉姆萨染色观察细胞形态学改变;应用碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色结合流式细胞术检测细胞周期分布;应用Real-timePCR检测细胞中CDK2mRNA水平变化;应用’western-blot检测CDK2及p-CDK2(Thr-160)蛋白水平变化;应用免疫荧光法检测细胞内CDK2与泛素蛋白(Ubiquitin,Ub)的共定位变化;采用免疫沉淀法检测CDK2与Ub的结合水平;选用COS-7细胞为瞬时表达宿主,共转染CDK2/CDK2-T160A和Ub考察CDK2和CDK2-T160A的泛素化降解情况.采用TNT(R)兔网织红细胞裂解液转录/翻译偶联系统体外表达CDK2重组蛋白。
　　 2)选用人AML细胞株NB4为主要研究对象,考察细胞内CDK2蛋白水平下降对ATRA诱导AML细胞分化作用的影响:采用台盼蓝染色结合血细胞计数板计数观察细胞增殖情况和细胞存活率,描绘细胞增殖曲线;细胞经CD11b-PE抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达;应用瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学改变;采用硝基四氮唑蓝(NBT)测试细胞还原能力;采用PI染色结合流式细胞术检测细胞周期分布的变化;应用western-blot检测CDK2蛋白,细胞周期蛋白(CyclinE、CyclinA),分化相关转录因子的表达(p-STAT1Try701,STAT1、PU.1、C/EBPβ)的表达情况;应用Real-timePCR检测细胞内以上蛋白和粒性细胞特异性表达的CSF3R的mRNA表达水平。
　　 研究结果:
　　 第一部分:ATRA促进CDK2通过泛素蛋白酶体途径降解
　　 1)药物诱导AML细胞分化和G0/G1期阻滞过程中CDK2发生明显下调
　　 检测细胞分化特异性表面抗原CD11b的表达,结果显示ATRA能够诱导NB4和U937细胞发生髓系分化,且呈时间依赖性关系。瑞氏-吉姆萨染色结果表明ATRA作用72小时后,NB4细胞分化为成熟粒细胞,U937细胞分化为成熟单核/巨噬细胞。PI染色结合流式细胞术的检测发现,ATRA能够诱导NB4细胞和U937细胞发生时间依赖性的G0/G1期阻滞。Western-blot检测结果显示,ATRA作用后,NB4细胞和U937细胞中CDK2蛋白水平呈现逐渐下调趋势,且与细胞的分化和周期阻滞进程高度一致。此外,在TPA和DMSO诱导NB4细胞分化和G0/G1期阻滞的过程中,CDK2蛋白水平亦发生明显下调,而采用周期同步化手段使细胞分布于不同周期阶段时CDK2水平则无明显变化,进一步提示CDK2蛋白下调与ATRA诱导AML细胞分化之间的密切关系。
　　 2)AML细胞分化过程中CDK2的下调依赖于蛋白酶体通路
　　 3)CDK2在不同体系中通过泛素蛋白酶体途径发生降解
　　 4)ATRA诱导AML细胞分化过程中促进CDK2通过UPS途径降解
　　 5)CDK2的160位点苏氨酸磷酸化水平对CDK2泛素化的影响
　　 第二部分:CDK2降解在全反式维甲酸诱导急性髓性白血病细胞分化中的作用及机制研究
　　 1)CDK2蛋白水平的下降增强ATRA诱导AML细胞分化的作用
　　 利用慢病毒转染技术将携带CDK2shRNA的质粒pLKO.1-CDK2＃1shRNA和pLKO.1-CDK2＃5shRNA以及相应的质粒空载pLKO.1(Vector)转入NB4细胞,筛选并构建稳定表达的细胞株。Western-blot检测结果显示与质粒空载相比,pLKO.1-CDK2＃1shRNA的沉默CDK2表达的效率接近100％,pLKO.1-CDK2＃5shRNA的沉默效率约为60%。
　　 2)CDK2蛋白水平下调协同ATRA诱导AML细胞分化的机制研究
　　 细胞周期同步化实验结合流式细胞术检测细胞周期分布的结果显示,NB4-Vector和NB4-CDK2shRNA细胞在同步化后细胞周期G0/G1、S、G2/M的进程均无明显差异,表明CDK2蛋白水平的下调并不影响NB4细胞的周期进程。ATRA作用于NB4-Vector和NB4-CDK2shRNA细胞后不同时间检测细胞周期分布,发现两组细胞均出现明显的G0/G1期阻滞,但无论在ATRA处理前或处理后,二者的周期分布情况无显著差异.上述结果表明,细胞内CDK2蛋白水平的下降对NB4细胞的细胞周期无影响,同时对ATRA诱导NB4细胞G0/G1阻滞的作用亦无影响,提示CDK2蛋白下调所引起的ATRA诱导细胞分化作用的增强并非由其促进细胞周期阻滞的作用引起。
　　 结论:本论文较为系统的探讨了ATRA分化诱导治疗AML过程中UPS介导的CDK2降解,并对其作用和相关机制进行了探讨。首先,我们首次证实CDK2可作为UPS途径的底物而被降解,ATRA在诱导AML细胞分化过程中促进CDK2通过UPS途径发生降解。其次,CDK2的降解能够促进ATRA诱导AML细胞分化的作用,且这种促进作用并非由促进细胞退出增殖周期所介导,而是通过直接调控分化相关转录因子的信号网络而实现。本文阐述了CDK2在AML细胞分化过程中的全新调控方式和功能,为进一步完善和开发新型的白血病分化诱导治疗策略提供了理论基础。