假单胞菌L-1菌株(Pseudomonas sp. L-1 strain)L-肉碱代谢酶系及转化研究

摘要

L-肉碱(L-(-)-Carnitine)，又称维生素BT，化学名为L-β-羟基-γ-三甲铵丁酸。在自然界中广泛存在，是一种基本的细胞成分。主要功能是在脂肪代谢过程中作为载体，将长链脂肪酸以脂酰肉碱的形式从胞质转运至线粒体基质，促使脂肪酸在线粒体内进行β-氧化，为细胞提供能量。目前，L-肉碱已广泛应用于医药、保健、食品和饲料等领域，市场需求较大，促使人们不断研究和改进L-肉碱的生产工艺。目前，工业上偏向于应用微生物酶转化法生产L-肉碱，较化学合成法具有成本低，污染少以及能耗低等优势。
　　 本研究从土壤中分离得到一株能够将γ-丁基甜菜碱转化为L-肉碱的菌株L-1，并对其进行了分类学鉴定，确定该菌株为Pseudomonas属。并对该菌株进行了L-肉碱代谢酶系及转化的研究，主要结果如下：
　　 1.菌株的筛选及鉴定：经富集培养和划线分离纯化后，得到了一株能够将γ-丁基甜菜碱转化为L-肉碱的菌株L-1，经形态学研究、生理生化测定、16S rDNA及系统发育分析，确定菌株L-1为Pseudomonas属。
　　 2.γ-丁基甜菜碱羟化酶基因(bbh)的克隆与表达：通过PCR克隆得到了γ-丁基甜菜碱羟化酶基因bbh(GenBank登录号：JQ250036)，对该基因的氨基酸序列进行了多重比对和系统发育分析，结果显示该酶与多个假单胞菌属和伯克氏菌属的γ-丁基甜菜碱羟化酶在系统发育上较为接近，但相似度最高的只达到76％，表明L-1菌株的BBH与已报道的其他γ-丁基甜菜碱羟化酶差异性较大。三维结构预测结果显示，菌株L-1的BBH单体具有两个结构域，除了主要的酶反应活性中心之外，在N端有一功能未知的结构域。将bbh基因的开放阅读框克隆到pET-15b表达载体中，成功地实现了菌株L-1的γ-丁基甜菜碱羟化酶基因在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的高效表达。
　　 3.重组γ-T基甜菜碱羟化酶的纯化及性质研究：离心收集IPTG诱导表达后的重组大肠杆菌，超声波破壁后离心得到粗酶液。粗酶液经His·Bind Resin柱纯化及硫酸铵沉淀后，比活达到0.115 U/mg。SDS-PAGE和分子筛层析结果表明，BBH为同源二聚体，亚基分子量约46.5KDa。最适反应温度为30℃，最适反应pH为7.5。该酶在45℃以下稳定。在pH6.0时该酶有最高的pH稳定性。以表达bbh基因的重组大肠杆菌静止细胞转化L-肉碱，于30℃，pH7.0的条件下转化31h后L-肉碱产量达12.7mmol/L。
　　 4.菌株L-l的L-肉碱脱氢酶基因cdh的敲除及γ-T基甜菜碱代谢途径研究：通过PCR的方法得到了L-肉碱脱氢酶的基因，然后将该基因的开放阅读框克隆到原核表达载体pET-15b中，将重组质粒转到大肠杆菌中进行表达，证实了该基因编码的酶具有L-肉碱脱氢酶活性。然后采用同源重组的方法将L-1菌株的cdh成功地进行了敲除，使L-肉碱积累量提高了3.2倍。HPLC-MS分析表明，菌株L-l存在另外一条降解γ-丁基甜菜碱途径，即通过在三甲胺部分进行脱甲基作用将其转化为其他物质进行代谢。