雷帕霉素对卵清蛋白诱导引起的哮喘肺部炎症的保护作用及其免疫机制研究

摘要

支气管哮喘(asthma，简称哮喘)是一种由多种细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症疾病，表现为可逆性气道阻塞、气道高反应性(AirwayHyperresponsiveness，AHR)、气道炎症细胞浸润、特定炎症因子表达量增高和气道重塑、气道粘液分泌等。目前还存在许多难治性哮喘患者因为对一些常规治疗哮喘的药物不敏感，从而导致患者病情进行性加重，最后发展成为重症哮喘，给家庭社会都带来了沉重的经济负担和精神压力。因此，进一步研究哮喘疾病发生发展的分子机制，探索有效的治疗药物，对提高难治性哮喘患者的生存率、减轻肺功能的损伤意义深远。
　　 以往被普遍认为哮喘的主要发病机制之一是Th2免疫反应站优势的Th1/Th2免疫反应失衡。流行病学调差显示：近些年来，许多不典型哮喘病例的发病有增高趋势。科学家们针对目前的现状深入开展了许多科学研究，随着一些新型Th细胞群(如Th17以及Treg细胞)的发现以及对其功能的研究，使得人们对哮喘发病机制的认识也更上一个台阶了，从过往的经典的Th1/Th2失衡机制逐渐转换为多类Th细胞群(Th1、Th2、Th9、Th17以及Treg细胞)参与的免疫失调机制。
　　 雷帕霉素(Rapamycin或RAPA)是一种新型的大环内脂类免疫抑制剂，起初雷帕霉素被研究作为低毒性的抗真菌药物，1977年发现雷帕霉素具有免疫抑制作用，随着对它的深入研究，我们了解到它通过不同的细胞因子受体阻断信号传导，阻断T淋巴细胞及其他细胞由G1期至S期的进程，从而发挥免疫抑制效应。1989年开始把RAPA作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行试用。近10年来，也有文献报道RAPA能够抑制哮喘小鼠气道炎症，但是对哮喘炎症抑制效应的分子机制还不明确。本研究主要通过建立哮喘小鼠模型，观察雷帕霉素对哮喘小鼠气道炎症的影响及其可能免疫机制，一期望为临床治疗难治性哮喘的新药开发提供新的干预方向。
　　 目的：构建卵清蛋白诱导引起的急性哮喘的动物模型，探索雷帕霉素在哮喘小鼠气道炎症中的作用及其相关免疫机制。
　　 方法：6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠按体重大小编号，根据随机数字表产生随机数字，按照随机数字大小分组，将实验小鼠平均分为SHAM组、SHAM+RAPA组、OVA组和OVA+RAPA组。SHAM组给予PBS致敏雾化，RAPA组为小鼠PBS或者OVA雾化前1小鼠腹腔注射雷帕霉素(1mg/kg)。观察各组小鼠肺泡支气管灌洗液中细胞总数、分类细胞计数、病理学检测；采用荧光定量PCR测肺、脾脏组织中炎症因子以及炎症因子受体的表达；采用ELISA的方法检测肺组织匀浆中炎症因子的表达；采用流式细胞术检测肺组织中CD4+T细胞和CD4+IL-17A+T细胞比例和数量的改变；采用流式细胞术检测肺、胸腺和淋巴结中CD4+Foxp3+T细胞的比例和数量的改变。
　　 结果：本实验利用卵清蛋白致敏雾化构建急性哮喘模型。通过对SHAM组和OVA组的BALF细胞数、肺组织病理学以及炎症因子表达等多项指标的检测，符合急性哮喘模型的特征，提示造模成功。通过雾化前1h腹腔注射RAPA实验系统性给药，与OVA组相比，RAPA干预哮喘小鼠之后，BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞以及淋巴细胞比例和绝对数量均有明显下降(P<0.001)，抗原暴露引起的中性粒细胞数量增高的现象也在RAPA干预之后明显减少，又统计学差异(P<0.05)；肺组织病理学HE染色结果提示：RAPA干预哮喘小鼠之后明显减少支气管血管之间的炎症细胞浸润，支气管上皮增生肥厚现象也明显改善(P<0.01)，值得注意的是RAPA干预基础状态下的实验小鼠，能刺激之气管上皮增生肥厚(P<0.05)；肺组织病理学PAS染色结果提示：RAPA干预之后，抗原诱导的肺组织内粘液分泌增多受到抑制，表现为PAS阳性颗粒数明显减少(P<0.001)，Q-PCR检测粘蛋白Muc5AC的基因表达水平也被RAPA干预抑制(P<0.05)；炎症因子(如IL-13、IL-17A、IL-25)以及炎症因子受体(IL-17RB)的mRNA表达下调(P<0.05)；肺组织匀浆中炎症因子(IL-17A和IL-6)下调(P<0.05)；流式细胞术检测Th17细胞群比例明显减少(P<0.05)，而调节性T细胞(Treg)比例改变不明显(P>0.05)。
　　 结论：RAPA对急性哮喘气道炎症具有保护作用，其可能机制是下调炎症因子及炎症因子受体，减少炎症细胞在肺内的浸润；下调IL-17A产生性T细胞群的数量及其功能；RAPA对急性哮喘气道炎症的保护作用不通过Treg细胞群的调节作用来实现免疫调控作用。