局灶性脑缺血大鼠内源性神经干细胞的分化以及神经营养因子分泌情况的研究

摘要

背景：
　　 脑缺血、外伤等病理情况下的神经再生过程目前并没有完全研究清楚。关于缺血后受损神经功能修复的多种可能机制中，一种假说是新生神经元直接取代受损的神经元，重建长程传导束，从而恢复受损的神经功能；另外一种假说是内源性神经干细胞分泌神经营养因子来促进功能的恢复。
　　 目的：
　　 确认成年大鼠局灶性脑缺血后诱导的内源性神经干细胞增殖分化为神经元后能否有新生投射神经元的出现，并重建受损的长程神经传导束；以及研究局灶性脑缺血后神经干细胞可能存在的分泌功能，揭示神经营养因子对脑缺血后神经功能恢复可能起到的促进作用。
　　 方法：
　　 本实验主要是分为两部分。第一部分主要是应用超声多普勒探头实时监测局部脑血流(regionalCerebralBlowFlow，rCBF)制作大脑中动脉梗阻(Medialcerebralarteryocclusion，MACO)模型来模拟局灶性脑缺血损伤的形成，然后通过使用免疫荧光双重染色及逆行示踪结合免疫荧光方法来研究成年大鼠局灶性脑缺血损伤后内源性神经干细胞的增生及分化情况。第二部分主要是通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)和逆转录聚合酶链反应(Reversetranscriptpolymerasechainreaction，RT-PCR)方法研究成年大鼠局灶性脑缺血后三种神经营养因子，神经生长因子(Nervegrowthfactor，NGF)、脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF)和神经营养素-3(Neurotrophin-3，NT-3)的分泌情况。
　　 结果：
　　 在第一部分，我们发现在大鼠局灶性脑缺血后，存在于侧脑室下区(Subventricularzone，SVZ)和海马齿状回(Dentategyrus，DG)的内源性神经干细胞开始增殖，基本上在损伤后第一周新生细胞数目即达到高峰，随后逐渐下降，术后4周时增殖的细胞与对照组无明显的差异。增殖后的内源性神经干细胞可以向缺血损伤周边区域迁移。增殖的新生细胞最终可以分化为中间神经元，但是不能分化为投射神经元，亦不能重建受损的长程神经传导束。
　　 在第二部分，ELISA结果显示脑缺血损伤可以促进多种神经营养因子的分泌，分泌时相和内源性神经干细胞的增殖一致。我们发现，缺血性损伤以后，成年大鼠脑脊液(Cerebrospinalfluid，CSF)内的几个主要的神经营养因子NT-3，NGF的蛋白含量明显增加，基本上在脑缺血术后第一周蛋白水平达到最高，随着MACO术后时间的延长，蛋白含量均呈下降趋势，数据存在一定的统计学意义。而BDNF的蛋白表达同其他两个营养因子存在差异，BDNF蛋白含量在脑缺血后的4周内呈现“U”字形的表现，虽然同样是在术后1周左右达到高峰，随后下降，但是2周后又从低谷重新表达增多，在4周出现新的表达高峰。RT-PCR结果显示NT-3、BDNF、NGF的mRNA的转录在不同时间、不同的脑组织区域有差异性表现。基本的趋势是缺血同侧的mRNA的转录水平随着缺血后时间的延长而逐渐升高，相反的，缺血对侧的脑皮层内的mRNA的转录水平却是随着缺血后时间的延长而逐渐降低。
　　 结论：
　　 我们的研究结果表明成年大鼠局灶性脑缺血损伤可以提高SVZ区和DG区的细胞增殖。同时，新生的细胞继而形成神经元，不过新生的神经元的分化却是有选择性。我们认为，新生神经元能够分化为中间神经元，但是不能分化为投射神经元。同时，无法重塑因脑缺血损伤所致的长程神经传导束结构的障碍。局部回路的可塑性以及神经营养因子的支持作用可能对成年大鼠的局灶性脑缺血损伤后神经功能的恢复更为重要。