MiR-375靶向转录调控因子Sp1在宫颈癌进展中的作用及其机制研究

摘要

宫颈癌是全球女性最常见的妇科恶性肿瘤之一。高危人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HR-HPV)感染是宫颈癌发病的必要因素，已经在99.7％的宫颈癌组织中证实HPVDNA的存在，其中HPV16、18是最为常见的高危类型。研究表明，HR-HPV表达的病毒癌基因E6和E7，可分别结合降解宿主细胞P53和Rb，并通过一系列分子事件，引起细胞周期、增殖、侵袭、转移等生物学行为改变，促进细胞的恶性转化，最终导致宫颈癌发生与进展。
　　 miRNA(microRNA，miRNA)是一类非编码小分子单链RNA，通过与靶基因mRNA(messengerRNA)序列的3’非翻译区或编码区结合在转录后水平调控基因的表达。miRNA参与了细胞凋亡、代谢、分化、激素分泌等生理过程。近年发现，miRNA也在肿瘤发生发展等病理过程发挥重要作用，并在病毒感染性疾病中与病毒的感染、清除、复制等过程密切相关。
　　 miR-375是一个研究较为广泛的miRNA。在我们以往的宫颈癌组织miRNA芯片研究中发现，miR-375在宫颈癌组织中与正常组织相比明显下调。为了确定miR-375在宫颈癌进展过程中的作用，本研究首先验证miR-375在宫颈癌和正常组织中的表达差异，并比较分析miR-375的表达水平与宫颈癌不良预后因素的相关性。再通过基因功能实验，探寻miR-375的异常表达在宫颈癌细胞侵袭转移中的可能作用并确定其发挥作用的靶基因，以明确miR-375发挥生物学功能的机制。最后利用组织标本和功能实验，探讨miR-375在宫颈癌中的表达失调与HR-HPV癌蛋白的相互关系。旨在寻找可用于宫颈癌预后预测和治疗靶点的miRNA，为探寻宫颈癌防治新策略提供科学依据。
　　 第一部分，miR-375在宫颈癌中的表达及意义
　　 目的：
　　 验证miR-375在宫颈癌组织中表达下调，探讨miR-375与宫颈癌不良预后因素之间的相关性。
　　 方法：
　　 收集宫颈鳞癌组织和正常上皮组织标本，采用Stem-loopRT-PCR和RealtimePCR法检测170例宫颈鳞癌组织和68例宫颈正常上皮组织的miR-375的表达水平，收集完整并整理病例的临床病理资料，分析miR-375的表达水平与宫颈癌临床不良预后因素的相关性。
　　 结果：
　　 1.miR-375在宫颈鳞癌组织的表达水平与宫颈正常上皮组织相比显著下调。
　　 2.miR-375表达与FIGO分期、盆腔淋巴结转移、深间质浸润、阴道壁累及以及脉管浸润有关。
　　 结论：
　　 1.miR-375的表达水平在宫颈癌组织与正常组织相比显著下调。
　　 2.miR-375低表达可能与宫颈癌预后不良因素相关，提示组织miR-375测定可能可以用于预测宫颈癌预后。
　　 第二部分，miR-375靶向转录调控因子Sp1在宫颈癌进展中的机制研究
　　 目的：
　　 明确miR-375对宫颈癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的调控作用，并确定miR-375发挥功能的靶基因，以揭示miR-375参与宫颈癌进展的作用及分子机制。
　　 方法：
　　 在宫颈癌细胞株Siha和CaSki中，利用细胞转染技术过表达miR-375或siRNA干扰转录调控因子Sp1的表达，利用MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞技术检测细胞周期分布，划痕试验和Transwell侵袭试验检测细胞的迁移和侵袭能力，并利用RealtimeRT-PCR和WesternBlot的方法检测Sp1的mRNA和蛋白水平，最后利用双荧光素酶报告基因的方法确认miR-375与Sp1的靶向关系。
　　 结果：
　　 1.在宫颈癌细胞株中，过表达miR-375可降低Siha和CaSki细胞的增殖能力，并阻滞细胞周期于G1期，使细胞的G1期细胞数明显增加，S期细胞数下调，抑制细胞划痕的愈合能力和细胞的侵袭功能。
　　 2.在宫颈癌组织中miR-375表达与Sp1mRNA水平呈负相关，过表达miR-375可下调Sp1的mRNA水平和蛋白水平。
　　 3.miR-375与含Sp13'UTR区的双荧光素酶报告质粒共转染，可下调荧光素酶的活性，而不影响3'UTR区突变报告质粒的荧光素酶活性。
　　 4.在宫颈癌细胞中，干扰Sp1的表达可抑制Siha和CaSki细胞增殖，阻滞细胞周期于G1期，并抑制细胞的迁移和侵袭能力。
　　 结论：
　　 1.在宫颈癌细胞中，过表达miR-375可抑制细胞增殖、阻滞细胞周期于G1期、并抑制细胞的迁移和侵袭，提示miR-375表达下调参与了官颈癌的进展过程。
　　 2.Sp1是miR-375的直接靶基因，miR-375通过靶向Sp1调控宫颈癌细胞的生物学功能。
　　 第三部分，miR-375表达与病毒HPV16E6、E7相关性探讨
　　 目的：
　　 确定细胞miR-375表达与HR-HPV感染及E6/E7表达的相关性，探索HPV病毒蛋白靶向调控宿主细胞miR-375表达和miR-375靶向调控病毒癌基因的作用。
　　 方法：
　　 采用Stem-loopRTPCR的方法检测不同HR-HPV感染状态的宫颈正常上皮组织中的miR-375的表达，利用用HPV16E6/E7表达质粒在C33A细胞中表达E6/E7，利用siRNA技术干扰Siha细胞表达E6/E7，检测不同E6/E7表达水平情况下miR-375的表达水平。同时在Siha细胞过表达miR-375，利用RealtimeRTPCR和WesternBlot法检测病毒癌基因E6/E7的表达及其下游分子P53、Rb、MCM7蛋白的表达。
　　 结果：
　　 1.在HR-HPV感染和无感染的宫颈正常上皮组织中，miR-375的表达水平无显著统计学差异。
　　 2.HPV16E6/E7表达质粒转染C33A细胞或E6/E7siRNA干扰Siha细胞引起E6/E7表达上调或下调，miR-375的表达水平均无显著变化。
　　 3.单纯HPV16感染的宫颈病变组织中，miR-375的表达与E6/E7mRNA水平呈负相关。
　　 4.在宫颈癌细胞株Siha中，过表达miR-375可下调E6/E7mRNA及E7和MCM7蛋白水平，并上调P53、pRB蛋白水平。
　　 5.在HCT-116细胞株中，过表达miR-375，P53、pRB和MCM7的蛋白水平无明显改变。
　　 结论：
　　 1.在宫颈癌细胞中，上调miR-375表达可抑制E6/E7的表达，并影响其下游分子P53、Rb及MCM7的表达。
　　 2.HR-HPV感染及E6/E7的表达状态不影响miR-375的表达水平。