Galectin-1减轻Flt3L诱发的小鼠同种异体肝移植急性排斥反应及相关机制研究

摘要

第一部分：小鼠同种异体肝移植自发免疫耐受相关机制研究
　　 目的
　　 小鼠同种异体肝移植在没有免疫抑制治疗的情况下自发形成免疫耐受，但其机制至今尚不明确。本研究旨在分析小鼠同种异体肝移植自发免疫耐受过程，探讨Th1及相关细胞因子、Th17及相关细胞因子、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞、树突状细胞及同种反应性T细胞凋亡等在小鼠肝移植自发免疫耐受中的作用及相关机制。
　　 方法
　　 建立小鼠同基因(C3H→C3H)和异基因(B6→C3H)肝移植模型，通过病理组织检测和免疫组织化学染色分析小鼠肝移植术后移植肝免疫应答过程；实时荧光定量PCR法检测肝移植术后移植肝IFN-γ和IL-17mRNA水平；流式细胞术检测肝移植术后移植肝Th1、Th17和CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比率及变化趋势；TUNEL(TdT-mediateddUTPnickendlabeling)法检测移植肝原位细胞凋亡、流式细胞术TUNEL法检测移植肝淋巴细胞凋亡情况；通过给予供体小鼠注射FMS样酪氨酸激酶3配体(fms-liketyrosinekinase3ligand，Flt3L)以增加供肝功能成熟的树突状细胞数量，探讨供体来源树突状细胞在异基因肝移植中的作用。
　　 结果
　　 (1)小鼠异基因肝移植术后早期(4天、7天、14天至30天)移植肝有大量炎性细胞浸润，移植肝病理表现为典型的移植排斥反应，同基因肝移植术后早期移植肝虽然也有炎性细胞浸润，但持续时间和浸润程度均较轻；(2)异基因肝移植术后早期(4天、7天和14天)移植肝IFN-γ和IL-17表达水平明显升高并显著高于同基因肝移植组，流式细胞术结果显示移植肝浸润细胞Th1和Th17细胞比例显著增加，免疫组织化学染色也进一步证实移植肝有大量IL-17+细胞浸润；(3)异基因肝移植术后移植肝和受体脾脏中CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞比例明显升高(7天左右达高峰)，之后开始下降，术后100天与正常小鼠无差异；(4)异基因肝移植术后早期移植肝浸润细胞和受体脾脏T细胞区域细胞发生大量凋亡(术后7天达高峰)，流式细胞术证实移植肝浸润CD8+T细胞和CD4+T细胞均发生凋亡；(5)供体Flt3L预处理显著增加供肝功能成熟的树突状细胞数量，并能够打破小鼠异基因肝移植自发免疫耐受，诱发肝移植急性排斥反应。
　　 结论
　　 (1)小鼠同种异体肝移植自发免疫耐受并非受者对移植肝不产生免疫应答(“免疫忽视”学说)，而是经历了短暂的移植排斥反应；(2)Th1和Th17细胞是介导小鼠同种异体肝移植术后早期排斥反应的效应细胞；(3)供者特异性效应性T细胞由于凋亡而被选择性清除是小鼠同种异体肝移植自发耐受的重要机制；(4)CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在肝移植自发耐受的诱导和维持阶段均发挥免疫调节作用；(5)供体来源树突状细胞在决定移植肝被排斥还是耐受中发挥关键性作用。
　　 第二部分：Galectin-1抑制Flt3L诱发的小鼠同种异体肝移植急性排斥反应及相关机制研究
　　 目的
　　 给予供体注射FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)能够显著增加供肝功能成熟的树突状细胞数量，从而打破小鼠异基因肝移植自发免疫耐受，诱发移植肝被排斥。半乳糖凝集素1(Galectin-1)能够诱导活化T细胞凋亡、抑制Th1和Th17型免疫反应，抑制树突状细胞功能并与调节性T细胞功能密切相关。本研究旨在探讨galectin-1在防治Flt3L诱发的小鼠同种异体肝移植急性排斥反应中的作用及相关机制。
　　 方法
　　 建立小鼠同基因和异基因肝移植模型；实验分为供体Flt3L预处理联合rGal-1处理组、单纯供体Flt3L预处理组以及空白对照组；探讨rGal-1腹腔注射对供体Flt3L预处理诱发的肝移植急性排斥反应的影响及相关机制。
　　 结果
　　 (1)小鼠异基因肝移植术后移植肝Galectin-1表达升高，但单纯galectin-1阻断无法诱导小鼠异基因肝移植急性排斥反应；(2)Galectin-1注射能够显著延长供体经Flt3L预处理的移植肝生存时间，减轻Flt3L诱发的肝移植急性排斥反应；(3)Galectin-1注射能够显著减轻Flt3L诱发移植肝Th1和Th17细胞浸润程度，抑制Th1和Th17相关细胞因子表达，并促进抑制性细胞因子IL-10的产生；(4)Galectin-1注射对移植肝CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞无显著影响；(5)Galectin-1注射显著增加移植肝浸润T细胞和受体脾脏T细胞区域的细胞凋亡率；(6)Galectin-1能够抑制树突状细胞介导的同种CD4+T细胞增殖。
　　 结论
　　 Galectin-1能够抑制供者Flt3L处理诱发的小鼠异基因肝移植排斥反应，其机制包括：抑制Th1和Th17免疫反应、促进IL-10的分泌、促进同种反应性T细胞凋亡以及抑制供者来源树突状细胞功能。