脂肪间充质干细胞移植对大鼠小体积肝移植术后肝损伤的治疗作用及机制研究

摘要

实验目的：
　　 小体积肝移植术后移植物损伤可严重影响供肝功能，甚至诱发小体积综合征，危及受体生命。文献报道脂肪间充质干细胞(ADSC)移植可缓解局部组织微循环障碍，改善肝损伤，促进肝再生，但其能否保护小体积肝移植物未见报道。本研究拟探索ADSC移植对小体积肝移植物的保护作用及相应机制。
　　 材料与方法：
　　 无菌提取大鼠腹股沟脂肪带的ADSC，体外培养扩增，并进行诱导分化实验及表面标记物鉴定。通过RNA干扰技术构建包含GFP及抑制大鼠VEGF表达的短发夹RNA(shRNA)或阴性对照shRNA的质粒，经慢病毒载体包装后转染ADSC，特异性阻断ADSC表达VEGF。提取大鼠肝窦内皮细胞(LSEC)，与不同浓度的转染阴性对照shRNA的ADSC(NC-shRNAADSC)及转染干扰VEGFshRNA的ADSC(VEGFi-shRNAADSC)共培养，24小时后采用AnnexinV/PI试剂盒流式检测LSEC的凋亡比例。建立35％的大鼠小体积肝移植模型，术中经门静脉移植2×106NC-shRNAADSC或VEGFi-shRNAADSC，对照组经门脉输注等体积的Hanks缓冲液。观察各组大鼠术后100天生存情况，进行血清肝功能及病理学检测(H&E、透射电子显微镜)，采用荧光显微镜进行活体肝脏灌注检测，通过实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹检测SFSLT术后各组肝脏内皮素-1(ET-1)、内皮素受体A(ETAR)、Bcl-2、Bax、Bad、p-bad的表达，采用免疫组织化学方法检测肝脏标本PCNA、ⅤⅢ因子的表达，并检测肝脏那个冰冻标本的GFP荧光，示踪移植入的ADSC。
　　 结果：
　　 (1)体外共培养实验表明：与相同数量的VEGFi-shRNAADSC相比，3×105NC-shRNAADSC与LSEC共培养可明显降低LSEC的凋亡水平。(2)NC-shRNAADSC移植组大鼠的肝功能(ALT、AST)及生存率显著高于对照组及VEGFi-shRNAADSC移植组。(3)肝脏切片H&E染色显示NC-shRNAADSC移植组大鼠的肝脏微结构基本正常；与之相比，对照组及VEGFi-shRNAADSC移植组大鼠的肝脏结构明显破坏，表现为肝窦结构紊乱、局灶性肝细胞坏死及汇管区炎症细胞浸润等。透射电子显微镜下观察NC-shRNAADSC移植组的肝窦超微结构基本正常，而对照组及VEGFi-shRNAADSC移植组的肝窦内皮细胞线性结构破坏，可见细胞核皱缩等凋亡表现。(4)活体肝脏灌注检测显示NC-shRNAADSC移植组的肝窦微循环状态明显优于对照组及VEGFi-shRNAADSC移植组，表现为肝窦灌注指数高、肝窦直径小。(5)实时荧光定量PCR结果显示NC-shRNAADSC移植组的ETAR表达水平明显低于其他两组，且该组的Bcl-2/Bax比值明显高于对照组，Bad表达水平明显低于对照组及VEGFi-shRNAADSC移植组；免疫蛋白印迹结果与PCR结果一致，并表明NC-shRNAADSC移植组的p-Bad表达明显高于其他两组。(6)NC-shRNAADSC移植组的ⅤⅢ因子及PCNA免疫组化染色阳性的细胞比率均明显高于对照组及。VEGFi-shRNAADSC移植组。(7)术后第1天及第7天的大鼠肝内可见GFP阳性细胞，术后第14天及第30天的大鼠肝内未发现GFP阳性细胞。
　　 结论：
　　 小体积肝移植术后脂肪间充质干细胞移植可显著改善小体积肝移植物的肝功能、肝脏血流灌注状态，减少肝脏细胞凋亡，并促进肝细胞及肝脏微血管再生。脂肪间充质干细胞的这些作用主要是通过分泌血管内皮生长因子来实现的。