木聚糖酶基因的体外定向进化及其高拷贝重组酵母的构建

摘要

木聚糖是谷物类饲料中一种主要的抗营养因子，通常需要添加内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)破坏木聚糖长链结构，释放出短链木寡糖，在木糖苷酶(EC3.2.1.37)的协同作用下，木聚糖可最终被水解成木糖。近年来，内切木聚糖酶已被广泛应用于饲料、食品和制浆造纸工业等，此外以木糖为底物生产燃料乙醇的研究也具有广阔前景。然而，目前木聚糖酶仍存在酶的催化活性不高、酶学特性不能满足工业加工或生产应用的需求或酶的生产成本较高等不足，亟需开发兼具高活性且酶学特性优良的理想木聚糖酶基因及其高效表达宿主。本研究克隆了糖苷水解酶家族11的4种内切木聚糖酶基因和1种木糖苷酶基因，以其中的优良基因为基础对其进行分子改良，构建了相应的高拷贝重组酵母表达宿主，在摇瓶中发酵表达内切木聚糖酶和木糖苷酶，并对底物形态和水解特性进行分析。主要结果如下:
　　 1内切木聚糖酶与木糖苷酶基因的克隆及原核表达
　　 本研究克隆了家族11黑曲霉(Aspergillus niger xylanase，anx)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis xylanase，bsx)、褐色高温单孢菌（Thermomonospora fuscaxylanse，tfx）和杂合内切木聚糖酶(hybrid xylanse，atx)基因以及枯草芽孢杆菌来源的木糖苷酶(B.subtilis xylosidase，xylo)基因，并在大肠杆菌中进行表达。酶学特性分析发现，所有木聚糖酶均在酸性条件下较为稳定。其中，ATx和Tfx兼具高酶活性和良好的热稳定性，且Tfx具备良好的抗抑制剂特性和一个家族11木聚糖酶少有的碳水化合物结合域(carbohydrate binding module，CBM)。因此，atx和tfx可作为后续分子改良的基因材料。
　　 2 atx的分子改良及重组酵母菌的构建
　　 基于非理性设计思路，采用定向进化提高atx的催化活性。定向进化策略包括易错PCR(error-prone PCR，EP-PCR)产生随机突变，在微孔板上筛选木聚糖酶活性提高的优势突变体。一轮EP-PCR后共筛选1530个转化子得到一个酶活性提高的突变体基因FSI-A124。将atx和FSI-A124分别转化毕赤酵母(Pichiapastoris) GS115，在PGAp启动子和α交配因子信号肽的控制下分泌表达木聚糖酶，96 h发酵上清液中比活性分别为954和1556 U/mg。突变酶YFSI-A124的Km为4.25 mg/ml，较之野生酶YATx下降4.7％，催化转化数kcat则提高44％。然而，酶学特性分析显示，YFSI-A124热稳定性略有下降。氨基酸比对和三维结构分析发现，L49P替换使得酶的催化区域变得柔和，突变酶与底物木聚糖的亲和能力增强，酶的催化效率提升，另一方面氢键作用、相邻氨基酸之间的范德华力和表面疏水作用减弱，导致酶的热稳定性下降。
　　 3tfx的分子改良
　　 综合非理性设计和理性设计的优势，采用定向进化和定点突变相结合的技术，提高tfx的催化活性和热稳定性。首先利用两轮EP-PCR随机突变，经微孔板筛选约7000个突变体，获得6个木聚糖酶活性提高的优势突变体。并对其中4处可能与酶的催化活性或热稳定性相关的氨基酸残基进行序列饱和突变。将优势突变体用于DNA shuffling和StEP进行优势重组，经筛选3000个转化子共获得3个木聚糖酶活性提高的优势突变体。之后，将S144C点突变引入G3DS2，使分子内产生一个新的二硫键，获得兼具高活性和良好热稳定性的突变基因G4SM1(S62T/S144C/N198D/A217V)。G4SM1的特异性比活为2036±45.8 U/mg，是野生酶Tfx的2.12倍，而Km值为1.84 mg/ml，较之野生酶显著下降(P＜0.05)，而kcat/Km提高76％，提示酶与底物的亲和能力增强，且酶的催化效率提高。三维结构分析显示，推测位于催化区的两处氨基酸替换S62T和S144C有助于提高酶的催化活性和稳定性。
　　 4构建包含高拷贝G4SM1基因的重组酵母菌
　　 采用两种不同的方法构建包含高拷贝G4SM1及其催化区G4SM1_CBM基因的重组酵母。一是采用高浓度抗生素压力法筛选酵母转化子，将电击后的转化子分别涂布于含500、1000、1500和2000μg/mlzeocin的YPD平板，在1500和2000μg/mlzeocin的平板上挑取阳性转化子进行拷贝数鉴定，Southern blot和qPCR分析显示，28号菌株为包含两拷贝G4SM1的重组酵母菌，命名为33-1。研究发现，Tfx中包含一段没有催化活性的CBM2，为了减少高拷贝外源基因对宿主的压力，将Tfx中不影响其其催化活性的CBM2截去，采用一对同尾酶BamHⅠ和BgⅡ将表达盒头尾相连，构建一个包含四拷贝表达盒的穿梭载体pGAPZαA/G4SM1_CBM(4)，再将该载体转化P.pastoris SMD1168获得包含四拷贝G4SM1_CBM基因的重组酵母33-2，Southern blot和qPCR进一步验证其正确性。
　　 5共表达内切木聚糖酶和木糖苷酶的重组酵母菌的构建及摇瓶发酵、底物形态和水解特性分析
　　 利用BamHⅠ和BglⅡ将pGAPZαA/G4SM1_CBM(4)与包含木糖苷酶基因的pPI CZαA/xylo相连接，获得共表达内切木聚糖酶和木糖苷酶的重组载体pαAX-GAPGC(4)，转化P.pastoris SMD1168获得共表达宿主33-3。将菌株33-1和33-2在YPD培养基中分泌表达内切木聚糖酶，培养120 h后发酵上清液中总蛋白含量分别为0.49 g/l和0.65 g/1。菌株33-3能在YPD培养基中仅表达内切木聚糖酶，同时也能在甲醇的诱导下共表达内切木聚糖酶和木糖苷酶，120 h发酵上清液中总蛋白含量达1.22 g/l。底物形态和水解特性分析显示，未处理的桦木木聚糖结构致密、表面粗糙，多糖分子粘连程度高，经内切木聚糖酶水解后，长链结构被破坏，分子呈现较小的颗粒状态，表面形态趋于平整。水解24 h后，木二糖和木三糖的浓度分别为0.954±0.093 mg/ml和0.360±0.022 mg/ml，分别占总水解产物的62.6％和23.6％。在内切木聚糖酶和木糖苷酶的协同作用下，木聚糖可彻底水解成木糖，水解24 h后，木糖的浓度为1.198±0.016 mg/ml，占总水解产物的69.1％。综上所述，本研究采用理性设计与非理性设计相结合的方法改良内切木聚糖酶基因tfx，构建的高拷贝重组酵母33-1和33-2、共表达重组酵母33-3摇瓶发酵蛋白表达量较高，可在发酵罐中进行高密度发酵进一步提高蛋白表达水平，在饲料工业和生物能源应用具有良好的应用前景。

目录

声明

缩略词

摘要

引言

第一章 文献综述

第一节 木聚糖的来源与结构

第二节 木聚糖酶

1 木聚糖酶的种类

2 木聚糖酶的结构

3 木聚糖酶的催化机制

第三节 木聚糖酶的应用

1 木聚糖酶在畜牧行业中的应用

2 木聚糖酶在制浆造纸工业中的应用

3 木聚糖酶在食品中的应用

第四节 木聚糖酶的分子改良

1 理性设计

2 非理性设计

第五节 木聚糖酶的高效表达策略

1 外源基因表达系统

2 启动子

3 基因拷贝数

4 信号肽

5 发酵参数优化

第六节 本研究的目的、意义和主要研究内容

1 本研究的目的和意义

2 研究内容

第二章 内切木聚糖酶与木糖苷酶基因的克隆及原核表达

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 内切木聚糖酶和木糖苷酶基因的扩增

2．2 重组表达质粒的鉴定

2．3 原核表达木聚糖酶和木糖苷酶的纯化及SDS-PAGE分析

2．4 原核表达木聚糖酶和木糖苷酶的活性及酶学特性分析

2．5 木聚糖酶的抗抑制特性分析

2．6 木聚糖酶的进化树分析

3 讨论

第三章 木聚糖酶基因atx的分子改良及重组酵母工程菌的构建

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 高活性木聚糖酶突变体的筛选

2．2 重组酵母表达载体的构建

2．3 重组酵母表达宿主的构建

2．4 木聚糖酶基因atx及突变体基因FSI-A124在毕赤酵母中的表达

2．5 木聚糖酶蛋白的纯化和去糖基化分析

2．6 突变酶YFSI-124的酶学特性分析

2．7 野生酶及突变酶的动力学分析

2．8 野生酶及突变酶的序列和结构分析

3 讨论

第四章 木聚糖酶基因tfx的分子改良及双拷贝重组酵母工程菌的构建

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 木聚糖酶基因tfx的分子改良

2．2 构建包含多拷贝突变体基因的酵母表达宿主

2．3 两拷贝重组毕赤酵母分泌表达G4SM1

3 讨论

第五章 共表达高拷贝木聚糖酶G4SM1催化区和木糖苷酶的重组酵母工程菌的构建

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 主要仪器

1．3 试验方法

2 试验结果

2．1 碳水化合物结合域的粘附能力研究

2．2 单拷贝表达载体的构建

2．3 A540T点突变

2．4 构建包含四拷贝G4SM1催化结构域的表达载体

2．5 构建共表达四拷贝内切木聚糖酶和木糖苷酶的表达载体

2．6 重组酵母工程菌的鉴定

2．7 重组酵母菌株分泌表达外源蛋白

2．8 木聚糖酶的水解特性分析

2．9 傅里叶变换红外光谱分析

2．10 底物表面形态分析

3 讨论

第六章 小结、创新点和后续研究展望

1 小结

2 创新点

3 后续研究展望

参考文献

附录一 pUCm-T vector

附录二 pET-30a(+)Vector

附录三 pET-22b(+)Vector

附录四 pGAPZαA Vector

附录五 pPICZαA Vector

作者简介及主要发表论文

致谢