新的可视化定量化DNA双链断裂修复检测体系的建立及在斑马鱼中应用研究

摘要

有机体的正常生长、发育和繁殖需要正确完整的遗传信息。然而体内（如水解，氧化，烷基化，复制碱基错配等）和体外（射线辐射，紫外辐射，不同的化学试剂等）多种不同物理化学因素的影响经常会造成遗传信息的携带者的DNA损伤。DNA损伤最严重的形式是DNA双链断裂。如果DNA断裂不能正确的修复，这不仅影响有机体的正常发育和衰老，而更重要的是基因组的不完整性会导致我们人类容易患上免疫缺乏，神经系统紊乱和癌症等疾病。为了减少DNA双链断裂带来的伤害，有机体进化出三种DNA双链断裂修复途径，即同源重组修复途径(HR)、单链退火修复途径(SSA)及非同源末端连接途径(NHEJ)。检测不同DNA双链断裂修复途径一般采用绿色荧光蛋白为报告基因，通过在报告基因中引入大范围核酸酶（如I-SceI）切点，构建可检测不同修复途径载体。到目前为止，绝大部分的研究工作都是在细胞系中完成的，对于这三种修复途径在有机体发育过程中的作用和调控还鲜有报道。在此项研究中我们通过新的设计，利用斑马鱼模式生物，构建了三个可视化并且可定量化的DNA双链修复检测体系分别检测HR，SSA和NHEJ。在新的设计中我们采用正反两个I-SceI大范围核酸酶的酶切识别位点代替传统的一个酶切位点来创造DNA双链断裂，此种设计可将单酶切产生的DNA双链断裂的粘性末端变为非粘性末端，从而大大降低粘性末端带来的末端直接连接修复。结果显示采用新的设计我们不但可以在斑马鱼胚胎中通过绿色荧光的表达清楚观察到NHEJ、SSA和HR修复，而且各种修复的频率可通过我们全新设计的引物采用定量PCR(qPCR)的方法定量检测。DNA断裂处修复后DNA序列分析结果不仅进一步证实HR、SSA修复的发生，并且显示在胚胎发育过程中NHEJ在此三种DNA双联修复途径中占主导地位。
　　 为了测试这三个报告体系是否可以用于DNA双链修复中基因功能分析，我们通过反义吗啉代寡核苷酸分别敲低rad51(HR修复中的重组酶)，rad52(SSA修复中的单链DNA结合蛋白)和ligase4(NHEJ修复中的连接酶)，结果显示敲低这些基因的表达可显著影响相应修复体系的修复效率。非常有意思的是通过这些报告检测体系，我们研究发现敲低ligase4可以在一定程度上促进HR，相反的却在一定程度上抑制SSA。我们的研究表明斑马鱼是一个研究DNA双链断裂修复很好的模式生物，并且我们新的设计将会广泛用于其它模式体系研究。

目录

声明

致谢

摘要

文中缩写语及中文意思

第一章 绪论

1．1 DNA损伤及DNA损伤修复

1．1．1 DNA损伤

1．1．2 DNA损伤修复

1．2 DNA双链断裂修复

1．2．1 HR途径

1．2．2 SSA(单链退火修复)途径

1．2．3 NHEJ途径

1．2．4 DNA双链断裂修复的相关研究

1．3 斑马鱼的简介

1．3．1 斑马鱼早期发育简介

1．3．2 模式动物斑马鱼

1．4 相关实验技术简介

1．4．1 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)

1．4．2 吗啉代寡核苷酸(morpholino oligonucleaotides，MO)

1．4．3 显微注射

1．4．4 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)及实时荧光定量PCR(real time PCR，RT-PCR)

1．5 本研究的目的和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 斑马鱼

2．1．2 试剂和仪器

2．1．3 设计的引物

2．1．4 相关MO的订购

2．2 实验方法

2．2．1 HR双酶切质粒的构建

2．2．2 SSA双酶切质粒的构建

2．2．3 NHEJ双酶切质粒的构建

2．2．4 单酶切系统的构建

2．2．5 酒精沉淀法纯化DNA

2．2．6 基因组DNA的提取

2．2．7 蛋白质提取

2．2．8 蛋白免疫印记分析(western blotting)

2．2．9 修复后的EGFP克隆到p-EASY载体的方法

2．2．10 用于测试MO效果的质粒的构建

2．2．11 体外转录mRNA

第三章 实验结果

3．1 系统设计与构建的原理

3．2 三种途径的可视化和定量分析可以实现

3．3 NHEJ途径是斑马鱼早期发育中最主要的DNA双链断裂修复途径

3．4 抑制rad51表达后HR系统分析出HR途径修复减弱

3．5 SSA修复在敲低rad52后系统证实其显著降低

3．6 抑制ligaseⅣ后NHEJ途径的影响只能用体内I-sceⅠ酶切的系统来检测

3．7 抑制NHEJ途径可以增强HR修复，却也抑制SSA修复

第四章 分析与讨论

参考文献

HR质粒序列

SSA质粒序列

NHEJ质粒序列

作者简历