肌抑素对小鼠巨噬细胞的影响及肌抑素和生长抑素免疫中效果研究

摘要

肌肉形成及其维持是一个极其复杂的过程，受严密的机制调控，主要受激素、营养、生长因子、肌肉调节因子（MRFs）及运动的调控，这些因素相互作用形成复杂的调控网络。本研究针对该网络中的两条最重要的轴:正向调控轴GH/IGF-1和负向调控轴肌抑素，通过免疫中和手段，初步研究了调控该两条路径后对小鼠肌形成过程及生长的影响，同时还初步探索了肌抑素在对免疫细胞的调控方面的新型功能。主要研究内容和结果如下:
　　 1.肌抑素对巨噬细胞细胞因子分泌的调控及其通路
　　 本实验表明在高脂日粮饲喂的小鼠肌肉、脂肪和脾脏中均可检测到高水平肌抑素基因的表达，在脂肪和脾脏中同时还可以检测到高水平的巨噬细胞标志基因F4/80和CD68的表达;进一步研究发现在脾脏淋巴细胞可检测到肌抑素的表达，并且LPS可增加脾脏淋巴细胞肌抑素的表达（可达259.37％，P=0.082）;而进一步研究其对免疫细胞（巨噬细胞和树突状细胞）的影响发现，肌抑素主要可促进巨噬细胞炎症因子的表达，而对树突状细胞无显著影响。肌抑素处理可显著诱导骨髓来源巨噬细胞TNFα（最高可达545.71％，P=0.0011）、IL1β（最高可达14.97倍，P=0.039）、IL6(225.48％，P=0.012)等炎症因子的表达;对巨噬细胞系RAW264.7研究表明，小干扰RNA靶标ActRIIB受体后，肌抑素诱导的TNFα的表达受到抑制（抑制了50.43％，P＜0.01），预示着在RAW264.7小鼠巨噬细胞系中，肌抑素对TNFα的诱导表达是通过其ActRIIB受体;同样，小干扰RNA靶标ActRIIB受体后，肌抑素诱导的IL1β的表达也受到抑制(抑制了79.18％，P=0.01)，因此肌抑素也是通过ActRIIB受体诱导IL1β的表达;进一步深入研究肌抑素诱导TNFα及IL1β表达所激活的信号通路途径表明，肌抑素可能主要通过Smad（通路抑制剂可下调TNFα达51.72％，P=0.016）和JNK通路（通路抑制剂可下调TNFα达69.24％，P=0.0023）诱导TNFα的表达，而对IL1β的诱导表达可能主要通过Smad、p38及Erk通路，各通路抑制剂可分别下调IL1β达58.21％(P＜0.01)、55.64％(P=0.002)及37.8％(P＜0.05)。
　　 2.免疫中和生长抑素
　　 本实验构建、表达及纯化GM-CSF/SS和CTB/SS重组融合蛋白，分别免疫雌性BALB/c小鼠，与pBS组相比，GM-CSF/SS可显著增加免疫小鼠的体重4.62％(P＜0.05)，诱导高水平的抗生长抑素抗体的产生，同时该处理组血清生长激素水平显著增加了44.54％(P＜0.05)，相应的肌肉IGF-1 mRNA表达水平增加了94％;而CTB/SS处理小鼠后，体重并未如预期的那样显著增加，处理组血清中除均可检测到抗生长抑素抗体之外，还可检测到高水平抗CTB抗体水平，与对照组比较CTB/SS组抗CTB抗体水平增加了28.69％(P＜0.05)。结果表明GM-CSF/SS可有效诱导生长抑素抗体的产生及增加免疫小鼠体重，有望进一步应用于大型动物研究;而尽管CTB/SS同样可以诱导生长抑素抗体的产生，但可能是高水平的CTB抗体抑制了动物的生长及体重的增加。
　　 3.肌抑素单链抗体
　　 经过密码子优化、全基因合成成功构建了全长为759 bp的抗肌抑素单链抗体，并成功在大肠杆菌中表达，经纯化发现单链抗体可有效结合肌抑素(P＜0.05)，而且该单链抗体可显著促进成肌细胞增殖，高浓度(8μg/ml)的单链抗体可提高成肌细胞增殖活性达31.11％(P＜0.01)，而且还可以降低肌抑素诱导的成肌细胞增殖抑制达55.48％(P＜0.01)，显著抑制肌抑素所诱导的成肌细胞细胞周期蛋白抑制剂p21表达（降低了22.48％，P＜0.05）;而且单链抗体还可抑制过氧化氢所诱导的成肌细胞E3泛素连接酶atrogin-1(MAFbx)和muscle ring finger1(MuRF1)的表达，与高浓度过氧化氢组比较，单链抗体共处理组的MuRF1和MAFbx表达量分别下调了80.41％(P=0.00013)和57.94％(P=0.049);而且该单链抗体还可降低过氧化氢诱导的成熟肌纤维MuRF1的表达，显著下调了33.35％(P=0.014);最后荧光素酶报告基因结果表明，该单链抗体可显著抑制肌抑素在成肌细胞的Smad信号通路(P＜0.05)。

目录

声明

摘要

常见英文缩写词

引言

第一章 文献综述

第一节 肌形成过程及其调控

1．骨骼肌起源

2．出生后骨骼肌的生长发育

3．成年动物体骨骼肌的维持

4．肌肉萎缩

5．骨骼肌形成过程的调控

第二节 IGF-1对肌形成过程的影响及其调控

1．IGF-1在骨骼肌中的生物学功能

2．IGF-1对肌肉特异转录因子(MRFs)的调控

3．IGF-1对肌肉萎缩的抑制作用

4．IGF-1在骨骼肌细胞的信号通路

5．对IGF-1活性的调控

第三节 肌抑素对肌形成过程的影响

1．简介

2．组织表达分布

3．肌抑素的生物合成途径

4．生物学功能

5．对肌抑素活性的调控

6．肌抑素的信号转导通路

7．肌抑素拮抗研究进展

第四节 免疫中和技术及其载体

1．免疫中和技术

2．免疫佐剂及抗原投递载体

3．被动免疫与工程化抗体

第二章 肌抑素在小鼠淋巴细胞中的表达及其对巨噬细胞和树突状细胞的影响

第一节 小鼠肌抑素的组织器官表达分布

1．实验材料

2．实验方法

3．结果与分析

4．讨论

第二节 肌抑素对小鼠骨髓来源巨噬细胞的影响

1．实验材料

2．实验方法

3．结果与分析

4．讨论

第三节 肌抑素对小鼠巨噬细胞系RAW264．7的影响及信号通路研究

1．实验材料

2．实验方法

3．结果与分析

4．讨论

第四节 肌抑素对小鼠骨髓来源树突状细胞及其因子表达的影响

1．实验材料

2．实验方法

3．肌抑素对树突状细胞TNF-α、IL6及IL10基因表达的影响结果及讨论

本章小结

第三章 免疫中和生长抑素

第一节 小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子／生长抑素融合蛋白的构建、表达及其对小鼠生长的影响

1．实验材料

2．实验方法

3．结果与分析

4．讨论

第二节 霍乱毒素B亚基／生长抑素融合基因的构建、表达及对小鼠生长的影响

1．实验材料

2．实验方法

3．结果与分析

4．讨论

第四章 抗肌抑素单链抗体的合成、表达及其对成肌细胞和肌纤维的影响

1．实验材料

2．实验方法

3．结果与分析

4．讨论

第五章 论文创新点及后续研究展望

参考文献

攻读博士学位期间发表与录用的论文

致谢