多芳环化合物降解菌的筛选、特性及降解途径研究

摘要

多芳环类化合物是化学合成工业中的一大类重要原料，种类繁多，广泛应用于制药、化工和印染等行业，易造成水体、土壤等环境污染。丙酯草醚，[4-（2-（4，6-二甲氧基-2-嘧啶氧基）苄胺基]苯甲酸正丙酯]，是我国具自主知识产权的新型高效除草剂，丙酯草醚原药、油力（10％乳油制剂）和油力Ⅱ(10％悬浮剂)已获农药临时登记证和农药生产批准证书。然而，关于丙酯草醚的微生物降解特性和生物降解途径及其降解蛋白质组学的相关研究迄今未见报道，关于同时降解萘和丙酯草醚的基因工程菌也未见报道。本研究综合运用传统微生物学实验方法、核素示踪技术、现代生物技术和现代仪器分析技术，分别从化工园区污水处理厂活性污泥和常州市南郊施用过丙酯草醚的农田土壤中筛选、纯化获得丙酯草醚高效降解菌株Amycolatopsissp.M3-1和萘高效降解菌株Pseudomonadaceae sp.Nai8，系统研究丙酯草醚和萘的微生物降解特性，以[B环-4，6-14C]标记丙酯草醚和[C环-U-14C]标记丙酯草醚为示踪剂，研究丙酯草醚在水体和土壤中的生物降解途径，利用双向电泳技术初步鉴定了菌株M3-1降解丙酯草醚的降解功能酶，并利用原生质体融合技术，构建可同时降解丙酯草醚和萘的高效工程菌MN6。微生物降解丙酯革醚的特性及降解途径、代谢机制等进行系统的研究，有助于深入了解丙酯草醚在环境的行为，为合理、安全使用丙酯草醚和环境生物修复提供技术支持和理论指导，保证环境和农产品的安全性。
　　 本研究的主要研究结果如下:
　　 1.从自然界中富集、筛选出5株以萘为唯一碳源和15株以丙酯草醚作为唯一碳源生长的降解菌。对降解效果较好的菌株Nai8、M3-1和CY进行进一步研究，经生理生化和16S rDNA鉴定，菌株Nai8为Pseudomonadaceae sp.Nai8，M3-1为较罕见的地中海拟无枝酸菌Amycolatopsis sp.M3-1，CY为Bacillus sp.CY。菌株M3-1降解丙酯草醚的最适条件为35℃、pH6.0、接种量8％，底物浓度为100mg/L，培养25天，丙酯草醚降解率达63.30％。当丙酯草醚浓度高于300mg/L时，对菌株M3-1的降解效果有较强的抑制作用，并随着底物丙酯草醚浓度的增加而增强，而浓度较低时(＜150ppm)降解效果较好，较高浓度的丙酯草醚可以抑制菌株M3-1的生长繁殖速度，大大降低细胞内降解酶的生物合成速度，甚至抑制酶的合成。菌株Nai8降解萘的最适条件为30℃，pH7.0，接种量8％，培养100h，降解率达96.24％。
　　 2.以B-14C-ZJ0273和C-14C-ZJ0273为示踪剂，研究水体中丙酯草醚在Amycolatopsis sp.M3-1的催化下的代谢规律，在培养体系中有6种中间代谢产物被检测出有放射性活度，用LC-MS鉴定其结构，并推导出ZJ0273在水溶液中的代谢途径。首先其丙基酯键被水解形成M1—(4-(2-(4，6-二甲基-2-嘧啶氧基)苄胺基）苯甲酸;随后，M1上的侧链CH-NH键发生酰化反应生成M2-（4-（2-（4，6-二甲基-2-嘧啶氧基）苯甲酰氨基）苯甲酸;同时，M1通过水解CH-NH键生成M3—4，6-二甲基-2-嘧啶氧基苯甲酸，M2的CO-NH键也在Amycolatopsis sp.M3-1的催化下，发生水解反应形成M3，M3也是丙酯草醚在杂草中最主要的代谢产物;M3结构的醚键发生断裂反应生成M4-2-羟-4，6-二甲基-嘧啶和苯甲酸;M3嘧啶环上的甲氧基通过水解形成M5，即6-甲基-4-羟-2-嘧啶氧基苯甲酸，然后再通过进一步的水解生成M6—尿嘧啶（2，4-羟基嘧啶）和苯甲酸。在自然环境中（如土壤和淤泥中）M4、M6和苯甲酸均可以被其他微生物作为碳源和能源，促进微生物的生长与繁殖，并最终被降解成CO2和H2O。
　　 3.菌株M3-1对5种灭菌土壤红砂田(S1)、黄松田(S2)、黄泥田(S3)、淡涂泥田(S4)和黄石土(S5)中的丙酯草醚均具有去除作用。培养90天后，S1、S4和S3中丙酯草醚的残留量分别为48.60％、23.32％和5.31％。空白土样中丙酯草醚残留量均在缓慢的下降过程中，表明丙酯草醚在土壤中的光解、水解及矿化等自然消解作用对丙酯草醚有一定的去除作用，但是去除效果不明显。M3-1在5种未灭菌土壤中对丙酯草醚也具有很好的去除作用，培养90d，丙酯草醚在五种土壤中的残留量分别为33.50％，31.14％，31.52％，22.03％和4.22％。
　　 4.运用蛋白质双向电泳技术，丙酯草醚诱导菌株M3-1前后的蛋白变化进行了初步研究，结果表明，菌株M3-1经过丙酯草醚诱导之后，胞内蛋白图谱发生较大的变化，双向电泳检测出6个新蛋白点，5个表达量增加2倍以上的蛋白点（超过1倍上的蛋白质点多达16个以上），通过MALDI-TOF-MS鉴定出8个蛋白质，分别是Phosphoglycerate kinase、Citrate sysnthase、Lipase、Biotin carboxylase、aldehydrogenae、Small subunit aromaticoxygenase等与细胞生长与代谢相关的酶系。
　　 5.采用紫外诱变法，获得M3-1和Nai8的脯氨酸(Pro-)缺陷型菌株和天冬酰胺（Asn-）缺陷型菌株。通过原生质体融合，构建8株可以同时降解丙酯草醚和萘的工程菌，其中工程菌株MN2和MN6对萘和丙酯草醚的降解率较高，比原始菌株M3-1对丙酯草醚降解率(20d)分别提高了2.83％、6.87％，比菌株Nai5的降解率(48h)分别提高了10.82％和18.01％。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．多芳环化合物

2．多芳环化合物的生物降解

2．1 降解多芳环有机化合物的微生物种类

2．2 多芳环化合物生物代谢途径

2．3 多芳环化合物微生物降解机制

3．蛋白质组学在多芳环化合物生物降解研究中的应用

3．1 蛋白质组学

3．2 蛋白质组学在多芳环化合物生物降解中的应用

4 微生物降解基因与基因工程菌的研究

5 原生质体融合技术

6 选题依据和研究意义

第二章 高效降解菌的筛选和降解特性研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 培养基

1．3 溶液和缓冲液

1．4 主要仪器

2．实验方法

2．1 丙酯草醚原药纯化

2．2 降解菌富集、筛选和分离纯化

2．3 高效降解菌的鉴定

2．4 萘/丙酯草醚的降解率的测定

3．结果与讨论

3．1 萘/丙酯草醚提取率的测定

3．2 高效降解菌的筛选及鉴定

3．3 降解菌株的降解特性研究

4 小结

第三章 Amycolatopsis sp．M3-1降解丙酯草醚代谢途径的研究

1 材料和方法

1．1 实验试剂

1．2 实验材料和仪器

1．3 实验方法

2 结果与讨论

2．1 水体中Amycolatopsis sp.M3-1降解丙酯草醚规律及代谢途径

2．2 丙酯草醚在土壤中降解特性和规律

3 小结

第四章 丙酯草醚降解途径蛋白质组学研究

1 材料与方法

1．1 试验菌株与试剂

1．2 溶液配方

1．3 菌株培养与诱导

1．4 菌体收获

1．5 细胞破壁

1．6 双向凝胶电泳

1．7 图像采集和分析

1．8 质谱分析和数据库检索

2 结果与讨论

2．1 双向电泳结果分析

2．2 蛋白质点的MALDI-TOF结果分析

3．小结

第五章 丙酯草醚和萘降解工程菌的构建及降解性能研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与讨论

2．1 菌株Nai8和M3-1生长曲线

2．2 紫外诱变营养缺陷型与原生质体制备

2．3 原生质体融合与融合子鉴定

2．4 融合子的形态特征

2．5．融合子降解性能的测定

2．6 工程菌降解性能的研究

3 小结

第六章 结论和研究展望

1．主要结论

2．主要创新点

3．论文不足和研究展望

参考文献

博士期间发表的主要论文