微藻高油脂的生物合成与膜基萃取研究

摘要

利用微藻生产生物柴油，应对化石燃料日益枯竭和能源供应日趋紧张的同时，与环境二氧化碳的捕捉进行偶联，缓解温室效应，具有广阔的开发利用前景。但要微藻生物柴油实现商业化利用，真正替代石化燃料，还存在许多挑战，还有很长的路要走。特别是微藻油脂产量的进一步提高，油脂提取成本的进一步降低，如果可以在这两方面得到改进，无疑能为微藻生物柴油真正实现商业化打下坚实基础。针对这一问题，本论文以微藻Chlorella sp.为出发藻种，从微藻生物学的基因工程改造和微藻高浓二氧化碳的驯化培养两个角度强化微藻油脂富集，并且采用新型膜基萃取技术用于微藻油脂提取，以期解决提高微藻油脂产量和降低油脂提取成本等问题，主要内容包括以下五个方面:
　　 (1)构建小球藻自养条件下核心及油脂积累的代谢网络模型，并对其进行分析。通过部分解释环境压力对代谢流分布的影响，淀粉合成途径与TAG合成途径的竞争，说明代谢网络模型较为可靠。通过TAG合成途径与生物质合成途径的对比，结合CASOP算法分析，均发现脂肪酸合成及Kennedy途径，特别是DGAT酶，对于TAG的合成有很高的重要性，为产油微藻的基因工程改造提供指导。
　　 (2)对出发藻种Chlorella sp.进行分离、纯化与鉴定。采用抗生素组合处理法和平板划线分离法分别去除细菌和霉菌，获得无菌海水小球藻藻株，建立海水小球藻无菌培养体系。对比三种小球藻基因组DNA提取方法，植物基因组DNA快速提取试剂盒法，操作过程相对简单，所需时间相对较少，而该方法和改良SDS-CTAB法，均能够在保证DNA纯度的同时，获得较大的DNA总量和DNA产率。PCR扩增rbcL基因并进行序列测定，鉴定实验室海水小球藻属于海水普通小球藻，并对其进行系统进化分析。
　　 (3)采用农杆菌介导法转化普通小球藻，通过G418作为抗性标记进行转化子筛选，同时优化藻落PCR条件，将其应用于转化子的鉴定和稳定性监测。以PCR扩增获得酿酒酵母DGAT基因，构建pBI121-DGAT穿梭质粒，转化获得含有重组质粒的根癌农杆菌;以TAP作为藻菌共培养体系，根癌农杆菌转化普通小球藻，计算转化效率为127-148/106;优化藻落PCR条件，采用6％w/vChelex-100溶液，在温度100℃条件下，温浴10 min，有利于提高藻落PCR效果;藻落PCR应用于转化子的鉴定和稳定性监测，发现转化不稳定问题。
　　 (4)比较评价称重法、FT-IR法、尼罗红染色法三种油脂含量测定方法，采用气升式光生物反应器进行高浓二氧化碳驯化与油脂富集。大规模培养且需低频率监测时，称重法优先选用;实验室规模且需中频率监测时，FT-IR法和尼罗红染色法均可选用，FT-IR法可以同时对油脂、蛋白质、碳水化合物含量进行定量，尼罗红染色法可以同时对中性脂滴进行定位;实验室规模且需高频率监测时，尼罗红染色法优先选用。驯化培养藻体细胞浓度1.37 g L-1，为普通小球藻藻种在烟道气等高浓二氧化碳环境中的应用提供了可能;驯化培养油脂产量589 mg L-1和油脂含量47.2％，实现了在普通小球藻高浓二氧化碳驯化的同时，进行油脂的富集;1.0％CO2情况下，CO2固定速率达到最大值，为106.9mg L-1 h-1。
　　 (5)建立微藻油脂的膜基萃取技术。比较六种普通小球藻细胞破碎方法，高压均质为适宜的细胞破碎方法，处理3次后，细胞破碎效率为91.7％，油脂损失率为19.3％，释放油脂得率为74.0％;比较三种中空纤维膜材料，PVDF（细孔）为适宜的中空纤维膜材料，内外表面静态接触角分别为75.0°和77.1°，内表面为平整网状结构，外表面为粗糙且多孔结构，存在大量10-100 nm圆形孔洞，断面为中间海绵层两端指状孔结构;比较两种有机萃取剂，乙酸乙酯为适宜的有机萃取剂，萃取率和总萃取率分别为56.2％、45.4％。优化操作条件，最佳水相流量为40 mL min-1,折合膜外侧流速为0.28 cm s-1，最佳有机相流量为21 mL min-1，折合膜内侧流速为2.79 cm s-1，萃取率和总萃取率分别为71.3％、57.5％;初步将其应用于浓缩藻液萃取，藻液浓缩2.5倍、5倍、15倍、30倍，萃取率和总萃取率分别为65.2％和52.9％、57.4％和46.8％、45.9％和37.8％、36.1％和30.1％。

目录

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致谢

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 微藻油脂代谢途径

1．2．1 甘油三酯(TAG)的生物合成途径

1．2．2 Kennedy途径强化TAG生物合成

1．3 微藻遗传转化

1．3．1 遗传转化方法

1．3．2 选择标记与启动子

1．3．3 蛋白表达的影响因素

1．4 富油微藻培养

1．4．1 培养装置选择

1．4．2 二氧化碳去除

1．4．3 油脂富集

1．5 微藻油脂提取技术

1．5．1 亚临界水或乙醇萃取法

1．5．2 原位油脂萃取法

1．5．3 膜基油脂萃取法

1．6 本研究课题的提出

参考文献

第二章 小球藻油脂积累的代谢网络分析

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 代谢网络的重建

2．2．2 网络分析的算法

2．2．3 网络分析内容

2．3 结果与讨论

2．3．1 自养代谢网络的建立

2．3．2 环境压力对代谢流分布的影响

2．3．3 淀粉合成途径与TAG合成途径的竞争

2．3．4 TAG合成途径与生物质合成途径的对比

2．3．5 CASOP分析结果

2．4 小结

参考文献

第三章 小球藻的分离、纯化与鉴定

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 藻种及培养条件

3．2．2 小球藻的分离与纯化

3．2．3 小球藻基因组DNA的提取

3．2．4 小球藻rbcL基因的扩增与进化树分析

3．2．5 小球藻的保藏

3．3 结果与讨论

3．3．1 小球藻无菌培养体系建立

3．3．2 小球藻DNA提取方法比较

3．3．3 小球藻藻种鉴定与系统进化分析

3．4 小结

参考文献

第四章 外源DGAT基因转化普通小球藻

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 DGAT基因来源与穿梭质粒构建

4．2．2 农杆菌介导转化普通小球藻

4．2．3 藻落PCR条件优化

4．2．4 普通小球藻转化子稳定性监测

4．3 结果与讨论

4．3．1 pBI121-DGAT构建与农杆菌转化

4．3．2 藻菌共培养体系选择

4．3．3 普通小球藻转化

4．3．4 藻落PCR条件选择

4．3．5 转化子鉴定与稳定性监测

4．4 小结

参考文献

第五章 高浓二氧化碳驯化与油脂富集

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 总脂与中性脂测定

5．2．2 气升式光生物反应器装置

5．2．3 驯化与产油指标测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 油脂测定方法比较

5．3．2 驯化与产油结果分析

5．4 小结

参考文献

第六章 膜基萃取普通小球藻油脂

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．2．1 普通小球藻破碎方法

6．2．2 中空纤维膜性能测定与组件制备

6．2．3 实验装置示意图

6．2．4 水相及有机相中油脂含量测定

6．3 结果与讨论

6．3．1 细胞破碎方法选择

6．3．2 中空纤维膜组件选择

6．3．3 有机萃取剂选择

6．3．4 膜基萃取条件优化

6．3．5 浓缩藻液萃取

6．4 小结

参考文献

第七章 结论与展望

7．1 全文主要结论

7．2 主要创新点

7．3 不足与展望

附录

作者简介