大豆农杆菌介导转化RNAi花叶病毒衣壳蛋白基因研究

摘要

大豆花叶病毒病由大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)引起，是世界范围大豆生产区的主要病害之一。大豆花叶病毒属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属（Potyvirus），可通过受侵染的种子，蚜虫和机械接种传播，它不仅会引起大豆植株矮化、叶片皱缩、花叶、顶枯等症状，而且还会使大豆种粒斑驳，降低大豆的产量及其外观品质，大豆花叶病毒病一般会造成病田减产10％-30％，严重时甚至造成大面积绝产，给大豆生产造成巨大的经济损失，全球范围内大豆种质交流和新的强毒力病毒株系的不断出现，使大豆安全生产面临挑战。种植抗病毒品种是防治大豆花叶病毒病最根本的有效策略。
　　 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是多种生物体内由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)介导的同源mRNA降解现象，是植物体内天然的抗病毒机制。由此发展起来的RNAi技术已成为当今植物基因功能研究和遗传改良的一个重要手段。RNAi技术可以有效地应用于大豆抗病毒分子育种中，创制优良的抗大豆花叶病毒病的大豆新种质。
　　 本研究以RNA干扰大豆花叶病毒衣壳蛋白(Coat protein，CP)基因为表达载体，Bar基因作为筛选标记基因，采用农杆菌介导大豆子叶节转化系统，获得了22株T0代大豆生根苗;这些T0代大豆生根苗经草丁膦涂抹法、PCR法和Bar试纸条法鉴定，均一致表明，其中18株大豆生根苗为T0代RNAi CP转基因植株;RNAi CP转基因株系在T1代的遗传分析表明，转入的基因片段可遗传，且遗传规律符合孟德尔定律;SouthernBlot试验表明导入的干扰片段在大豆基因组DNA中为单拷贝;大豆花叶病毒摩擦接种试验表明，RNAi CP转基因植株初步具有抗大豆花叶病毒特性，摩擦接种3周后，DAS-ELISA检测表明，RNAi CP转基因植株的大豆花叶病毒阳性检出率为7.69％，而非转基因植株的大豆花叶病毒检出率为100％。
　　 本研究获得的RNAi CP转基因大豆材料可作为SMV抗性种质资源，加快大豆抗病毒育种进程，有效地防治大豆病害的发生。

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摘要

第一章 文献综述

1 大豆花叶病毒研究进展

1．1 大豆花叶病毒的特性

1．2 寄主与病症

1．3 大豆花叶病毒的株系划分

1．4 大豆花叶病毒的传播

1．5 大豆花叶病毒分子生物学研究

1．6 大豆花叶病毒的防治

2 RNA干扰及其抗病毒遗传工程应用研究进展

2．1 RNAi现象的发现

2．2 RNA干扰的作用机制

2．3 RNAi技术在植物抗病毒研究中的应用

3 本研究的目的和意义

第二章 T0代RNAi CP转基因大豆生根苗的获得

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 农杆菌介导大豆子叶节转化法

2 结果与分析

2．1 农杆菌介导大豆子叶节转化体系的建立

2．2 T0代RNAi CP转基因大豆生根苗的获得

3 讨论

3．1 农杆菌介导大豆子叶节转化法的优点

3．2 Bar基因作为选择标记基因的优势

第三章 T0代RNAi CP转基因植株的鉴定

1 材料和方法

1．1 引物和试验材料

1．2 研究方法

2 结果与分析

2．1 RNAi CP转化植株的鉴定结果

2．2 大豆RNAi CP转基因的转化效率结果

3 讨论

3．1 转基因植株鉴定方法的比较

3．2 大豆转基因转化效率研究

第四章 转基因植株后代的分离及大豆花叶病毒抗性鉴定

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 Southern blot所需试剂的配制

1．3 研究方法

2 结果与分析

2．1 RNAi CP转基因大豆T1代的分离

2．2 Southern blot结果分析

2．3 RNAi CP转基因植株大豆花叶病毒抗性鉴定

3 讨论

3．1 转基因植株后代的遗传稳定性

3．2 RNA干扰技术的抗病毒效果

第五章 结论与展望

参考文献