高尔基体蛋白73(GP73)表达对高尔基体结构和蛋白转运的影响

摘要

目的:
　　 GP73作为新发现的在肝癌组织和血清中表达异常增加的高尔基体定位蛋白，其功能尚不明确，仅知道它与某些肿瘤如肝癌的发生密切相关，我们推测其可能对细胞高尔基体结构和功能的维持具有重要作用，但仍需要进一步研究。因此，本实验从改变GP73表达对细胞高尔基体形态结构和蛋白质转运的影响的角度去研究GP73在细胞中的生物学功能。
　　 方法:
　　 1通过基因工程方法设计并构建pGEX-5X-1-StxB重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达GST-StxB-His融合蛋白，采用GST亲和层析纯化蛋白，并使用肠激酶酶切GST-StxB-His融合蛋白获得StxB-His蛋白，用于后续实验;
　　 2本文通过脂质体瞬时转染GP73的特异性siRNA片段来降低细胞中GP73的表达，并通过Western blotting和细胞免疫荧光技术鉴定干扰效果;
　　 3采用细胞免疫荧光技术观察降低GP73表达的细胞中与高尔基体组装和结构维持相关的高尔基体蛋白GM130和Golgin84的胞内定位。
　　 4RNA干扰降低GP73表达，采用荧光淬灭后恢复（FRAP）技术观察高尔基体的连续性和流动性;
　　 5在降低GP73表达的Hela细胞中瞬时转染VSVG-GFP质粒，采用激光扫描共焦显微镜观察VSVG-GFP蛋白的胞内转运;
　　 6用StxB-His蛋白孵育细胞，通过细胞免疫荧光的方法观察在降低GP73表达的Hela细胞中StxB-His的胞内转运。
　　 结果:
　　 1本文通过基因工程方法成功获取了有活性的StxB蛋白;并通过RNA干扰的方法成功降低了HepG2及Hela细胞中GP73的表达。
　　 2降低HepG2和Hela细胞中GP73的表达，可引起GM130和Golgin84失去高尔基体紧凑结构，呈离散分布，而对反面高尔基膜囊标志蛋白TGN46没有影响;FRAP实验中，降低Hela细胞中GP73的表达后，高尔基体上指定区域内荧光淬灭后仍可恢复，但恢复速度明显减慢。
　　 3降低Hela细胞中GP73的表达对VSVG-GFP蛋白的正向转运没有影响，却可引起StxB蛋白的逆向转运延迟。
　　 结论:
　　 GP73蛋白可参与调控顺面高尔基体膜囊结构的维持和StxB的逆向转运途径，但对VSVG-GFP的胞内转运没有影响。

目录

声明

致谢

摘要

英文缩略词

1 引言

2 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．2 实验器材

2．3 实验方法

3 实验结果

3．1 StxB-His蛋白的获取

3．2 GP73的RNA干扰

3．3 GP73 RNAi后细胞内的高尔基体形态变化

3．4 胞内蛋白转运实验

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

综述 哺乳动物细胞高尔基体在细胞周期中的作用

作者简介及在读期间所取得的科研成果