植物线粒体反向调控途径中候选基因的筛选鉴定

摘要

线粒体反向调控途径（Mitochondrial Retrograde Regulation，MRR）是植物线粒体与细胞核之间发生信息交流的重要途径。当线粒体功能受到线粒体基因突变或逆境胁迫影响时，线粒体会将这些逆境信号通过一些信号分子或信号转导蛋白传递到细胞核，从而引起细胞核内基因的表达变化，进而影响细胞内的代谢活动。已知抗霉素A(AntimycinA，AA)可以抑制线粒体电子呼吸传递链，诱导编码交替呼吸途径交替氧化酶（Alternative oxidasela，AOXIa）的表达，因而常被作为线粒体反向调控研究的报告基因。AOXla可以响应多种逆境信号并被诱导表达。
　　 本研究以酵母线粒体反向调控机制和植物交替呼吸途径的产生机理为理论依据，以模式植物拟南芥为实验材料，一方面通过同源性筛选比对，获得了五个与酵母RTG（Retrograde）途径中的调控因子具有较高同源性的候选基因，并筛选获得了相应的T-DNA插入突变体，另一方面通过EMS诱变拟南芥Col(:) LUC材料得到ems2突变体。继而从这几个候选基因中筛选鉴定出参与线粒体反向调控的基因。同时，本研究以细胞质雄性不育系CMS和其保持系MF为实验材料，初步研究了茎用芥菜中交替氧化酶基因BjAOXla的调控机理。得出的主要结论如下:
　　 1 GRF3是植物线粒体反向调控途径中的负调控因子
　　 GRF3（General Regulatory Factor3）是拟南芥中与酵母反向调控途径负向调控因子Bmh1/2p具有较高同源性的基因。GRF3突变体（grf3）在受到50μMAA处理后，其过氧化氢(H2O2)的含量增多，AOXla的转录水平显著上调。当用20mMH2O2处理1小时后，grf3中AOXla迅速上调表达，上调幅度比AA处理小。NDB2(NAD(P)H dehydrogenase B2)是与AOXla协同表达的胁迫响应基因，研究发现AA处理后，它被诱导表达的趋势与AOXla一致。该结果从基因转录水平证明了GRF3是植物线粒体反向调控途径中的负调控因子。
　　 2 EMS2是植物线粒体反向调控途径中的正调控因子
　　 EMS2突变体（ems2）是拟南芥转基因植株Col(:) LUC经EMS诱变获得的，该突变体含有荧光素酶（LUCIFERASE,，LUC）的报告基因。AA或H2O2处理后，ems2中AOXla和NDB2被诱导表达水平均显著低于转基因植株Col(:) LUC，即从转录水平上证明了EMS2是植物线粒体反向调控途径中的正调控因子。
　　 3 CMS系中AA处理不能诱导BjAOXla的表达，其正调控基因BjCDKE1表达水平较低
　　 AA处理后，MF植株的BjAOXla基因被诱导表达，而CMS系中BjAOXla基因没有明显被诱导。未处理时，BjCDKE1基因在CMS中的表达水平明显低于MF，而被AA处理后，其表达在CMS中几乎没有变化，而在MF中显著下调表达。BjAOXla基因的具体调控机理仍待进一步研究。

目录

声明

致谢

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 线粒体反向信号

1．2 线粒体交替呼吸途径介导的反向调控机制

1．2．1 植物线粒体电子传递链的组成

1．2．2 线粒体呼吸交替途径

1．2．3 线粒体反向调控的标记基因AOX1a

1．3 植物14-3-3蛋白研究进展

1．3．1 植物14-3-3蛋白的发现、分布及种类

1．3．2 植物14-3-3蛋白的结构与作用模式

1．3．3 植物中14-3-3蛋白的功能

1．4 植物WD40蛋白研究进展

1．4．1 WD40蛋白的发现、分布及种类

1．4．2 植物WD40蛋白的结构

1．4．3 植物中WD40蛋白的功能

1．5 周期素依赖性蛋白激酶CDK

1．6 T-DNA插入突变体的鉴定原理

1．7 研究的目的和意义

2 拟南芥中与酵母RTG途径同源的MRR候选基因的筛选鉴定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 拟南芥的栽培及处理

2．2．3 单株总DNA的提取

2．2．4 总RNA的提取

2．2．5 cDNA第一链的合成

2．2．6 反转录PCR产物的纯化

2．2．7 T-DNA插入突变体的纯合子鉴定(PCR鉴定)

2．2．8 T-DNA突变体插入位点的确认

2．2．9 RT-PCR验证T-DNA插入突变纯合子的基因表达

2．2．10 绝对荧光定量验证差异基因的表达

2．2．11 过氧化氢(H2O2)含量的测定

2．2．12 统计分析

2．3 结果与分析

2．3．1 突变体的PCR鉴定结果分析

2．3．2 突变体插入位点的确认分析

2．3．3 突变体的RT-PCR分析结果

2．3．4 绝对定量表达结果分析

2．3．5 抗霉素A处理后过氧化氢(H2O2)含量差异

2．3．6 盐胁迫和渗透胁迫条件下对grf3根系发育的影响

2．4 讨论

3 拟南芥中EMS诱变法初步筛选MRR途径相关的候选基因

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料

3．2．2 拟南芥的培养

3．2．3 荧光素酶(LUC)发光活性法测定

3．2．4 总RNA的提取及cDNA第一链的合成

3．2．5 反转录PCR产物的纯化

3．2．6 绝对荧光定量验证差异基因的表达

3．3 结果与分析

3．3．1 不同胁迫处理后荧光素酶(LUC)发光活性的测定结果与分析

3．3．2 绝对定量结果分析

3．4 讨论

4 茎用芥菜中交替氧化酶BjAOX1α的调控机理的初步研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料及处理

4．2．2 总RNA的提取和cDNA第一链的合成

4．2．3 BjCDKE1中间片段的克隆

4．2．4 荧光实时相对定量(qRT-PCR)

4．3 结果与分析

4．3．1 BjCDKE1中间片段的同源克隆结果分析

4．3．2 BjCDKE1核酸序列同源性比对结果分析

4．3．3 抗霉素A处理对BjAOX1α和BjCDKE1基因表达的影响

4．4 讨论

5 结论

参考文献

附录 常规化学试剂和常用培养基的配制