蛋白二硫键异构酶和淀粉合成酶基因沉默对水稻耐热及结实特性的影响

摘要

高温胁迫是制约水稻产量潜力发挥和品质稳定的主要逆境因素之一，它对水稻产量和品质形成的影响作用，与水稻“库”、“源”器官中的碳、氮代谢过程存在着密切联系。本实验室的前期研究工作表明，蛋白二硫键异构酶基因(PDI)、可溶性淀粉合成酶的SSSⅠ和SSSⅢa基因，不仅是水稻“库”器官中的贮藏蛋白积累和淀粉合成途径的重要调控基因，而且对高温胁迫的响应也表现较敏感，可能是高温胁迫对稻米品质形成及其优劣产生影响的几个重要功能基因位点。为此，本文构建了淀粉合成酶SSSⅠ和SSSⅢa基因的RNAi沉默载体，以及PDI基因的RNAi沉默和超表达载体，并通过转化日本晴的愈伤组织，获得其转基因水稻植株，在此基础上，结合水稻在不同生育时期的高温胁迫试验，对上述基因沉默或超表达后的有关生理生态特征及相关基因的表达模式进行了研究分析。主要研究结果如下:
　　 1.以野生日本晴的发育籽粒为材料，通过PCR法克隆了PDI基因保守区450bp大小的靶标序列作为干扰区段，构建了含有内含子hpRNA(ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsPDI，经农杆菌介导转化日本晴，获得8株转基因植株;通过在T0代对其潮霉素(Hyg)抗性基因的PCR鉴定及Southern杂交检测，确证携带有干扰片段的T-DNA区已整合到水稻基因组中，且在转基因T1代符合3∶1的分离模式;半定量RT-PCR和荧光定量PCR的检测结果表明，PDI基因沉默转基因阳性植株不同器官中的PDI表达量均显著降低，尤其是其籽粒中的PDI表达量较微，几乎能引起靶基因80％左右的沉默;对转基因T2代植株的高温结实特性和籽粒理化品质的检测结果表明，PDI基因沉默会引起水稻的耐热性显著下降，在高温胁迫处理下的结实率大幅度降低，但其在常温处理下的结实率与对照之间无显著差异。此外，PDI基因沉默后，稻米的透明度下降、垩白度有所增加，但对籽粒粗蛋白总量和直链淀粉含量的影响不甚明显。
　　 2.以PCR法从日本晴发育胚乳中克隆了水稻PDI基因编码区(coding sequence region,CDS)，目标片段为1631bp，包含了PDI基因的全表达序列，构建了Ubiquitin启动子驱动的超表达载体pTCK303-OsPDI，并转化日本晴成熟胚的愈伤组织，获得有9株转基因阳性植株，T1代半定量RT-PCR检测结果显示，PDI基因沉默后，其幼苗器官中的PDI表达量显著低于其野生对照植株，而PDI基因的超表达则存在相反效果，表现出其抑制或促进PDI基因表达的效果;水稻苗期的高温生态试验结果揭示，PDI基因在高温胁迫下呈上调表达，但持续高温胁迫会引起PDI基因表达量的下降，但Bip基因在高温胁迫前期的表达量较低，随着处理时间的延长，其相对表达量大幅升高，与PDI基因呈“此消彼长”的变化趋势，两者可能在水稻抵御高温胁迫响应过程中起“互补”作用。
　　 3.利用PCR法分别克隆了水稻淀粉合成酶基因SSSⅠ和SSSⅢa保守区399bp和389bp大小的靶标序列作为干扰区段，分别构建了含有内含子hpRNA(ihpRNA)的双元表达载体pTCK303-RiOsSSSⅠ和pTCK303-RiOsSSSⅢa，转化日本晴后，分别获得了12株和13株SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默的阳性植株。半定量RT-PCR分析结果显示，SSSⅠ和SSSⅢa基因沉默后， T1代转基因植株苗期叶片中的SSSⅠ或SSSⅢa基因在常温下表达量均显著低于其对照植株，分别都起到了较明显的干扰效果，而其他同工型基因（如SSSⅡb、SSSⅢb、SSSⅣa、SSSⅣb）的表达水平并未受明显影响;在高温胁迫下，SSSⅠ基因RNAi沉默植株可溶性糖含量有所上升，其原因可能是SSSI基因受到抑制后由蔗糖转化为淀粉效率降低所导致;而高温胁迫下SSSⅠ和SSSⅢa基因RNAi沉默叶片器官中的SSSⅡb表达量均有所上升，可能是高温胁迫下SSSⅡb基因对SSSⅠ和SSSⅢa基因功能缺失的一种补偿效应。

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缩略词列表

摘要

第一章 文献综述

1 蛋白质二硫键异构酶(PDI)的生物学基础

1．1 蛋白质二硫键异构酶简介

1．2 PDI的结构特点

1．3 PDI的分子生物学功能

1．4 植物组织中的热激蛋白及其在水稻耐逆性上的应用研究

2 稻米品质与淀粉合成代谢

2．1 淀粉的化学组成及其与稻米品质的关系

2．2 淀粉的生物合成途径及其重要关键酶

2．3 淀粉合成代谢关键酶的重要同工型基因

3 RNA干扰技术

3．1 RNAi的主要干扰机制

3．2 RNAi的优点

3．3 内含子发卡结构对RNA干扰(ihpRNAi)的研究进展

3．4 RNAi在作物品质改良研究中的应用

4 本研究的目的意义

参考文献

第二章 水稻蛋白二硫键异构酶基因沉默载体构建及其转基因后代的高温结实特性分析

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 试验材料及试剂

2．2．2 水稻胚乳总RNA的提取纯化及cDNA的合成

2．2．3 PDI基因RNAi目标区段的选择、扩增及其亚克隆

2．2．4 RNAi表达载体pTCK303-RiOsPDI的构建

2．2．5 农杆菌EHA105介导表达载体pTCK303-RiOsPDI的水稻遗传转化

2．2．6 PDI基因沉默水稻植株的获得及其PCR检测

2．2．7 转基因水稻植株T1代的遗传分离鉴定

2．2．8 转基因水稻T2代PDI基因的表达水平分析

2．2．9 转基因水稻T2代的高温特性分析PDI基因表达的荧光定量PCR检测

2．2．10 稻米表观直链淀粉及粗蛋白的检测分析

2．3 结果与分析

2．3．1 PDI基因片段的亚克隆及测序

2．3．2 双元干扰表达载体pTCK303-RiOsPDI的构建

2．3．3 RNAi表达载体pTCK303-RiOsPDI导入农杆菌及其遗传转化

2．3．4 T0代转基因植株的获得及其T1代的分离鉴定

2．3．5 转基因T2代植株的农艺表现、高温结实特性与PDI基因荧光定量表达分析

2．4 讨论

2．5 小结

参考文献

第三章 蛋白二硫键异构酶基因的沉默与超表达对水稻苗期耐热性影响的生理特征

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 试验材料及试剂

3．2．2 水稻胚乳总RNA的提取纯化及cDNA的合成

3．2．3 PDI基因的克隆

3．2．4 超表达载体pTCK303-OsPDI的构建

3．2．5 农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化

3．2．6 PDI基因超表达水稻植株的获得及其PCR检测

3．2．7 PDI基因超表达和RNAi沉默转基因植株的苗期高温特性分析

3．2．8 转基因植株苗期PDI及Bip基因表达的荧光定量PCR检测

3．3 结果与分析

3．3．1 PDI基因的克隆及超表达载体pTCK303-OsPDI的构建

3．3．2 农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化及PDI基因超表达植株的获得

3．3．3 PDI基因超表达和RNAi沉默后代的PDI及相关基因表达特性

3．3．4 转基因材料中幼叶高温可溶性蛋白、脯氨酸及丙二醛含量差异分析

3．4 讨论

3．5 小结

参考文献

第四章 水稻淀粉合成酶基因SSSⅠ和SSSⅢa的沉默及转基因后代苗期的耐热性分析

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 试验材料及试剂

4．2．2 水稻胚乳总RNA的提取纯化及cDNA的合成

4．2．3 SSSⅠ和SSSⅢa基因RNAi目标区段的选择、扩增及其亚克隆

4．2．4 RNAi表达载体的构建及农杆菌介导的遗传转化

4．2．5 转基因水稻植株的获得及其PCR检测鉴定

4．2．6 RNAi沉默转基因植株的苗期高温特性分析

4．3 结果与分析

4．3．1 淀粉合成酶SSSⅠ和SSSⅢa基因的亚克隆

4．3．2 RNAi双元干扰表达表达载体的构建

4．3．3 RNAi表达载体导入农杆菌及农杆菌EHA105介导的水稻遗传转化

4．3．4 转基因T0代植株的获得及其PCR鉴定

4．3．5 RNAi沉默转基因后代淀粉合成酶相关基因的苗期高温特性分析

4．4 讨论

4．5 小结

参考文献

第五章 研究展望

附录