链霉菌高表达载体与标签载体的构建及其应用

摘要

链霉菌是一类生活在土壤中的革兰氏阳性菌，其能产生多种具有商业和科研价值的次级代谢产物、酶和免疫抑制剂等。近年来链霉菌已经逐渐发展为外源基因表达的宿主。本课题在pIJ8668载体和pIJ101复制子的基础上，构建了一组高表达载体pL97，pL98和pL99。pL97和pL98分别具有组成型启动子ermEp*和ssrAp，而pL99具有诱导性启动子PnitA-NitR系统。三个载体都具有pUC18和pIJ101的复制子，分别用于在大肠杆菌和链霉菌体内进行复制，同时oriT(RK2)原件使大肠杆菌到链霉菌的结合转移更加高效简便，转化子的筛选可以通过阿布拉霉素进行。在启动子和转录终止位点之间插入了一个多克隆位点用于外源基因的表达。前期实验我们将绿色荧光蛋白基因egfp和天蓝色链霉菌十二烷基灵菌红素(Red)的途径特异性调控基因redD克隆至上述三个载体中，Westernblot结果显示EGFP蛋白的表达与单拷贝的相比有了明显的提高，同时Red的产量通过组成型过表达redD也有了显著变化。因此上述三种载体可以用于外源蛋白的表达和次级代谢产物尤其是一些具有潜在应用价值的抗生素产量的提高。
　　 经过多年的研究，链霉菌遗传学已经取得了长足的发展，解析了大量基因的功能，但是在以研究蛋白质相互作用及蛋白质-DNA相互作用为基础的细胞内信号转导方面报道不多。本课题以整合性启动子探针质粒pIJ8660为骨架，将EGFP编码序列改为多克隆位点，并在其前端插入了组成型强启动子ermEp*，以此为基础，通过密码子优化，将3FLAG，3HA，13Myc，3Strep-tagⅡ，18His标签蛋白编码序列分别插入到启动子下游，构建了一系列含单个标签或者两个标签的载体，并以天蓝色链霉菌ECFsigma因子SigT为模型，成功实现了标签与蛋白的融合表达。在此基础上我们利用FLAG-His串联亲和纯化技术(TAP)结合LC-MS的方法鉴定出了与SigT相互作用的蛋白，其中包括SigT蛋白的抗sigma因子RstA。该系列标签载体的构建，为蛋白在链霉菌内的表达、检测与纯化提供了便利，为研究体内蛋白质相互作用及蛋白质-DNA相互作用打下了基础，并为在蛋白质组、基因组水平上通过TAP、ChIP-Seq方法筛选相关调控元件与调控靶点提供了有力工具。

目录

声明

摘要

缩略词和术语表

第一章 综述

1．1 前言

1．2 链霉菌宿主载体研究进展

1．2．1 链霉菌属来源的环状质粒

1．2．2 整合型质粒的发展

1．3 标签蛋白融合技术概述

1．3．1 常用的亲和标签

1．3．2 融合蛋白的优缺点

1．4 串联亲和纯化概述

1．4．1 TAP技术的原理

1．4．2 TAP技术的研究进展

1．4．3 TAP技术的优势、局限性及其改进

1．4．4 研究蛋白相互作用的其他方法

1．5 本文的研究内容及意义

1．5．1 本文的研究内容

1．5．2 本课题的意义

第二章 链霉菌高表达穿梭载体的构建及应用

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株或者质粒

2．2．2 引物列表

2．2．3 主要仪器与设备

2．2．4 培养基及培养条件

2．2．5 常用试剂

2．3 实验方法

2．3．1 主要PCR程序

2．3．2 大肠杆菌质粒抽提、酶切、胶回收及DNA片段连接

2．3．3 大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化

2．3．4 大肠杆菌到链霉菌的结合转移

2．3．5 链霉菌基因组抽提

2．3．6 链霉菌孢子悬液的制备

2．3．7 链霉菌蛋白的提取及SDS-PAGE和Western blot检测

2．3．8 表型分析和十二烷基灵菌红素(Red)产量测定

2．4 实验结果

2．4．1 pL97，pL98和pL99载体的构建过程

2．4．2 pL97，pL98和pL99载体图谱及验证

2．4．3 天蓝色链霉菌体内egfp基因的过表达

2．4．4 过表达途径特异性调控基因redD，提高十二烷基灵菌红素的产量

2．5 本章小结及讨论

第三章 链霉菌标签载体的构建及应用

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 菌株或者质粒

3．2．2 引物列表

3．2．3 主要仪器与设备

3．2．4 培养基及培养条件

3．2．5 常用试剂

3．3 实验方法

3．3．1 链霉菌中重组蛋白的表达(以整合型表达载体为例)

3．3．2 链霉菌体内蛋白的串联亲和纯化

3．3．3 胰蛋白酶的酶解

3．3．4 质谱检测

3．4 实验结果及讨论

3．4．1 系列标签载体的构建过程

3．4．2 系列标签载体图谱及验证

3．4．3 天蓝色链霉菌ECF sigma因子SigT在标签载体中的表达

3．4．4 SigT蛋白的串联亲和纯化及蛋白质复合体的质谱检测

3．5 本章小结

第四章 结论与展望

4．1 本文研究成果

4．2 展望

参考文献

附录

攻读硕士学位期间的主要研究成果

致谢