复杂天然药物有效成分的逆流色谱分离方法研究

摘要

天然药物化学是现代有机化学研究的重要方向之一，目前在国际医药市场上天然药物已占30％的市场份额。天然药物的广阔发展前景对天然产物分离技术提出了更高的要求。逆流色谱是一种无需固相载体的液液分配色谱，其已广泛应用于天然药物中指标性有效成分的分离。迄今为止的大多数研究集中在分离一些成分较简单的天然药物粗提物，直接分离复杂天然药物粗提物中活性成分的相关研究报道较少。本论文，主要通过逆流色谱方法对复杂天然药物中的活性成分进行有效的分离。具体研究包括以下几个方面:
　　第一部分应用pH区带精致逆流色谱制备分离云南地不容以及荷叶中的生物碱类成分。采用甲基叔丁基醚-乙腈-水溶剂体系（2∶2∶3，v/v，上相加入10mM三乙胺，下相加入5mM盐酸），从1.4 g云南地不容的生物碱粗浸膏中分离得到68.7 mg异紫堇定，78.2 mg紫堇定酚，583.4 mg四氢巴马汀，36.3 mgN-methylasimilobine以及47.3 mg番荔枝碱。此外，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶剂体系（1∶6∶1∶6，v/v，上相加入10mM三乙胺，下相加入5mM盐酸）从500 mg荷叶生物碱浸膏中分离得到7.4 mg N-demethylarmepavine，同时还获得45.3 mg荷叶碱以及26.6 mg的莲碱。上述结果显示，pH区带精致逆流色谱可以有效的应用于分离天然产物中的生物碱类化合物。
　　第二部分通过构建的快速溶剂体系筛选策略以及一台分析型的三柱并联逆流色谱仪快速筛选得到最佳的分段溶剂体系。仅80分钟筛选即获得了最佳溶剂体系，随后通过半制备逆流色谱分离，在100分钟时间内分离获得了6个片段，并通过LC/MS对不同部位进行检测分析。通过LC/MS分析了片段中包含的50个化合物。对不同的片段进行进一步的抗氧化活性筛选，发现片段Ⅰ为主要的活性片段，显示了很好的抗氧化活性。对比传统的活性筛选方法，本研究中建立的方法有以下优势:对植物粗提物的分段效率高，不同部位之间组分几乎不重叠;溶剂体系筛选策略快速方便。研究发现，该方法可以很好的应用于筛选天然药物中的活性部位，为进一步发现新药提供了有效的分离分析手段。
　　第三部分发展了新型的二维逆流色谱系统，在第一维使用一台柱体积为140mL的半制备型的逆流色谱仪器，在二维使用一台三柱并联的逆流色谱仪。一、二维之间的接口通过两个固相萃取柱以及一个四通切换阀实现。应用该系统成功分离了中药大黄中的蒽醌类化合物。通过在第一维使用洗脱推出逆流色谱方法，在第二维使用构建的酸碱洗脱逆流色谱方法，最终得到了四个高纯度的蒽醌类化合物。该方法为天然产物分离提供了一个新的选择:首先通过洗脱推出方法得到足够多的片段，然后对感兴趣的片段进一步通过二维逆流色谱分离，得到最后的目标化合物。
　　第四部分发展建立了分离紫背菜中活性化合物的方法。通过洗脱推出逆流色谱方法的高效分段以及在线抗氧化活性筛选实验，确定了紫背菜正丁醇部分的活性化合物。然后通过构建的多维逆流色谱系统，分离得到了两个抗氧化活性很强的目标化合物，绿原酸与咖啡奎宁酸。为此我们提出了新的天然药物活性化合物的筛选策略，首先通过溶剂体系快速筛选策略，确定用于分段的最佳溶剂。然后使用洗脱推出逆流色谱方法或者反推逆流色谱方法降低植物粗提物的复杂程度。接着结合在线活性筛选以及液质联用分析确认活性化合物，以及获取其基本的结构信息。最后通过二维逆流色谱方法分离目标的活性化合物。我们希望通过对该方法的进一步优化，使该筛选策略成为一种通用的分离天然产物活性化合物的方法。
　　此外，论文还就最近几年逆流色谱在仪器，溶剂筛选以及洗脱模式方面的最新研究进展进行了总结。

目录

摘要

第1章 逆流色谱综述

1．1 逆流色谱概述

1．2 逆流色谱在仪器上的研究进展

1．3 溶剂系统的选择

1．4 洗脱模式

1．4．1 推出方法(Extrusion method)

1．4．2 多维逆流色谱方法

1．4．3 梯度洗脱

1．4．4 双向洗脱模式

1．4．5 连续逆流萃取

1．4．6 pH-区带精致逆流色谱

1．5 本章小节

第2章 应用pH区带精致逆流色谱分离纯化天然产物有效成分

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂

2．2．2 逆流色谱仪

2．2．3 分配系数的测定

2．2．4 两相溶剂体系以及样品溶液的准备

2．2．5 逆流色谱分离步骤

2．2．6 高效液相色谱分析

2．2．7 结构鉴定

2．3 应用pH区带精致逆流色谱分离云南地不容中的有效成分

2．3．1 引言

2．3．2 粗提物的制备

2．3．3 保留剂与洗脱剂的选择与使用

2．3．4 粗提物的HPLC分析

2．3．5 pH区带精致逆流色谱溶剂体系选择

2．3．6 pH区带精致逆流色谱分离结果

2．3．7 化合物的结构鉴定

2．4 pH区带精致逆流色谱结合液质联用分离荷叶中的生物碱

2．4．1 引言

2．4．2 粗提物的制备

2．4．3 植物粗提物的LC-MS分析

2．4．4 相溶剂体系选择

2．4．5 pH区带逆流色谱分离结果

2．5 本章小结

第3章 洗脱推出逆流色谱方法结合液质联用快速筛选中药大黄中的抗氧化多酚化合物

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器

3．2．2 实验试剂

3．2．3 植物粗提物的制备

3．2．4 逆流色谱分离

3．2．5 LC／MS分析

3．2．6 抗氧化活性筛选实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 最佳两相溶剂体系的选择

3．3．2 逆流色谱快速分离大黄粗提物

3．3．3 LC／MS／MS分析

3．3．4 抗氧化活性筛选

3．4 本章小结

第4章 新型多维逆流色谱方法及应用

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验仪器

4．2．2 实验试剂与材料

4．2．3 植物粗提物的制备

4．2．4 多维逆流色谱分离

4．2．5 植物粗提物的LC／MS分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 多维逆流色谱系统

4．3．2 LC／MS分析

4．3．3 逆流色谱两相溶剂体系的选择

4．3．4 二维逆流色谱分离大黄乙醇粗提物

4．4 本章小结

第5章 紫背菜中抗氧化活性成分的快速筛选

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验仪器

5．2．2 实验试剂以及材料

5．2．3 植物粗提物的制备

5．2．4 逆流色谱分离

5．2．5 在线活性检测结合LC／MS分析

5．3 结果与讨论

5．3．1 EECCC对紫背菜正丁醇提取物的快速分段

5．3．2 在线活性筛选结合LC／MS分析

5．3．3 二维逆流色谱分离活性化合物

5．3．4 天然产物活性物质分离新策略

5．4 本章小结

全文总结

参考文献

攻读博士学位期间主要的研究成果

致谢

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