基于纳升级液滴阵列的实时定量RT-PCR系统的研究及其在单细胞中MicroRNA定量检测中的应用

摘要

基因扩增及定量分析是生命科学领域中应用最为广泛的关键平台技术之一，为生物学、环境学、农学、医学等领域带来了革命性的突破.基于微流控技术的PCR系统，不仅保持了传统PCR技术的特异性强、灵敏度高等优点，还具有试样消耗低、分析通量高、分析装置微型与集成等优点。特别是具备单细胞基因分析能力的微流控PCR系统，将有可能为以基因扩增和定量检测为基础的重大疾病早期诊断、产前检测、法医鉴定、细菌种群分类及蛋白质表达预测等研究领域提供一种重要的研究工具。
　　 本文第一章，对微流控PCR系统的发展和现状进行了综述。主要根据PCR反应器结构对已有的微流控PCR系统进行分类总结，并着重对具有单细胞分析能力的微流控PCR系统进行详细阐述。
　　 本文第二章，建立了一种半敞开式的纳升级平面液滴阵列平台，并将其应用于miRNA-122的实时定量RT-PCR检测中。利用平面液滴优势，在经表面修饰的亲水点阵列芯片上，实现了液滴的定位和多步加样操作。该微流控系统具有加工简单、操作灵活、易于普及等优点，可以作为一种通用型的微量生物化学反应平台。采用该系统进行多步的miRNA-122 RT-PCR扩增及实时定量检测，每个液滴反应器试样总消耗量仅为500 nL，检测限可达1000拷贝/液滴，检测线性范围跨越了6个数量级。与商品化实时定量PCR仪相比，试样消耗可降低70倍且检测性能相当.此外，还采用该系统对多种细胞中的miRNA-122含量进行了检测，测定结果与商品化PCR仪一致。在最低总RNA加入量为0.8 pg时，测定结果仍在检测线性范围内，证明了该系统在单细胞水平分析的应用潜力。该系统作为一种通用化的小型实时定量PCR平台，不仅可用于小RNA分析，还可用于其他RNA或DNA分析，在定量生物学研究中具有广阔的应用前景。
　　 本文第三章，在第二章工作基础上发展了一种自动化、高通量、低消耗、可控的纳升级微流控液滴阵列操控平台，并将其应用于单细胞中microRNA表达的高灵敏度定量检测中.该系统不仅能够实现皮升至纳升级不同体积、不同成分液滴的灵活生成，而且能够完成液滴内的可寻址试剂定量加入。采用该系统，成功实现了单细胞基因表达定量分析所需的反应器生成、单细胞捕获、细胞裂解、RNA逆转录、PCR扩增、实时定量荧光检测等多个操作的全集成，且每次实验可对256个液滴反应进行大规模平行操作与测定。实验中液滴反应器总体积降至50 nL，检测限可达30拷贝/液滴，检测线性范围跨越6个数量级。与商品化实时定量PCR仪相比，不仅试样消耗降低3个数量级，且扩增效率明显提高(93.43％)，检测限降低2个数量级。实验中，系统研究了PBS盐等细胞悬浮液中的添加剂对PCR扩增效率的影响，并采用浓度稀释的方法，有效减少了PBS溶液在RT-PCR反应中的抑制作用。首次在液滴系统中，实现了单个Huh-7细胞内miRNA-122的实时定量RT-PCR检测，展示了该系统在单细胞基因诊断领域的广阔应用前景.

目录

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致谢

摘要

第一章 绪论

§1．1 引言

§1．2 单相微流控PCR系统

§1．2．1 概述

§1．2．2 基于硅材料的单相微流控PCR系统

§1．2．3 基于玻璃材料的单相微流控PCR系统

§1．2．4 基于聚合物材料的单相微流控PCR系统

§1．2．5 小结

§1．3 多相(液滴)微流控PCR系统

§1．3．1 微流控乳液PCR系统

§1．3．2 基于平面液滴阵列的微流控PCR系统

§1．3．3 小结

§1．4 总结

参考文献

第二章 纳升级液滴阵列实时定量RT-PCR系统的研究

§2．1 引言

§2．2 实验部分

§2．2．1 实验材料及试剂

§2．2．2 实验溶液配制

§2．2．3 实验操作

§2．3 结果与讨论

§2．3．1 设计思想

§2．3．2 纳升液滴阵列实时定量RT-PCR系统的优化

§2．3．3 纳升级液滴阵列实时定量RT-PCR系统性能

§2．3．4 多种细胞中miRNA-122含量的测定

§2．4 结论与展望

参考文献

第三章 基于纳升级液滴阵列的自动化单细胞实时定量RT-PCR系统的研究

§3．1 引言

§3．2 实验部分

§3．2．1 实验材料及试剂

§3．2．2 实验溶液配制

§3．2．3 实验操作

§3．3 结果与讨论

§3．3．1 设计思想

§3．3．2 液滴生成及操控系统的优化

§3．3．3 高密度液滴阵列芯片设计

§3．3．4 基于纳升级液滴阵列的实时定量RT-PCR系统性能优化

§3．3．5 系统性能测试

§3．3．6 细胞悬液对RT-PCR反应抑制问题

§3．3．7 单细胞miRNA的实时定量RT-PCR检测

§3．4 结论与展望

参考文献

附录