Geobacillus sp.E263分子伴侣GroEL及骨架蛋白MreB在高温噬菌体GVE2感染中的作用

摘要

众所周知，噬菌体在感染宿主过程中会对宿主的DNA复制、RNA转录等生理过程进行改造，控制宿主菌的死亡，进而影响噬菌体所生存环境的生物群落和营养循环。虽然噬菌体感染的相关报道很多，但是高温噬菌体并没有被广泛地研究过，高温噬菌体与其宿主菌之间的相互作用我们更是知之甚少。对深海热液口高温噬菌体的研究，不但能让我们了解噬菌体控制深海热液口极端生态环境的内部机制，而且对海洋微生物资源的开发及生命起源的探索也具有非常重要的意义。
　　 本试验研究了深海热液口高温噬菌体GVE2与其宿主嗜热细菌Geobacillussp.E263之间的互作关系，发现宿主的天冬氨酸转氨酶(AST)、分子伴侣GroEL与GVE2的衣壳蛋白VP371之间存在着互作关系，三者构成一个线性复合体，即GroEL分别与AST和VP371互作，但AST与VP371之间不存在互作。其中，VP371为噬菌体GVE2的核衣壳蛋白，是噬菌体存活与感染都不可缺少的蛋白;AST可以催化氨基酸与酮戊二酸之间的转化，这是三羧酸循环中重要的一个中间过程，因此AST可能是维持高温环境下宿主细菌正常代谢所必须的中间酶;GroEL则是分子伴侣家族的一个重要成员，能够促进未正常折叠的蛋白正确折叠，尤其在高温这一蛋白容易变性的极端环境下，分子伴侣的作用尤为重要。本试验首先通过Northernblot和Westernblot研究AST、VP371以及GroEL这三种蛋白在GVE2感染中的转录与表达水平变化，证明了AST、GroEL均与GVE2的感染正相关，随着感染的发生，这两种蛋白都发生了上调表达。然后通过Co-IP与GST-pulldown这两种方法研究与AST、VP371分别相互作用的蛋白，证明AST与VP371均能与GroEL互作，而AST与VP371之间也存在互作，然而在随后采用细菌双杂交法进行体内的互作验证时发现，AST与VP371无法直接互作，但两者均能与GroEL直接互作，因此三种蛋白构成AST-GroEL-VP371线性复合体。本试验还通过免疫荧光标记法研究该复合体的体内定位情况，发现GroEL集中分布于杆状细菌的中间与两端，AST与VP371也与其呈现共定位关系。最后，本试验利用等温滴定量热法进行了蛋白互作热动力学的体外分析，研究了三种蛋白互作反应的热力学结合特性。综上所述，GroEL可能对VP371与AST这两种噬菌体感染中的关键蛋白的正确折叠起着促进的作用，从而有利于噬菌体的感染，说明噬菌体GVE2在进化过程中对宿主菌产生了适应机制。
　　 在研究AST-GroEL-VP371复合体的互作过程中，本试验曾使用一种在宿主菌中表达量与分布都非常稳定的蛋白MreB作为阴性对照。MreB是一种在大多数杆状细菌中都存在的actin（真核生物细胞的肌动蛋白）同源蛋白。它在维持细菌细胞形态以及引导细菌细胞壁肽聚糖合成过程中起着非常重要的作用。虽然MreB在宿主细菌中的表达及分布都较为稳定，不随着噬菌体的感染而发生变化，但本研究在后续试验中发现该蛋白与GVE2感染同样存在密切的联系。目前大多数关于病毒与细胞骨架蛋白相互作用的研究都来自真核生物。由于真核生物的骨架蛋白尤其是actin蛋白在细胞中具有重要作用，因而在漫长的进化过程中，病毒已经发展出了许多种利用actin的方式，其中最主要的是利用宿主细胞actin在摄食和小范围胞内运输（例如黑素体的运输）中的作用来帮助自己侵染和繁殖。MreB是actin的一种原核同源异构体，可想而知，噬菌体同样可能进化出利用宿主MreB的感染体系。以往的研究表明，枯草芽孢杆菌的MreB可参与其噬菌体phi29的DNA复制，并与该噬菌体的末端蛋白发生直接的相互作用，后续报道也指出MreB在phi29的基因组DNA复制过程中起到支架和牵引的作用。但是除此之外，宿主细菌MreB是否涉及噬菌体感染的其它几个步骤则尚未见报道，尤其在高温系统下，嗜热细菌的MreB蛋白在噬菌体感染过程中是否有类似的作用也同样未有文献证实。本试验从高温噬菌体GVE2的宿主细菌Geobacillussp.E263中克隆并表达了MreB基因，利用MreB的特异性抑制剂A22及MP265对MreB进行抑制处理，并构建了GVE2拷贝数的荧光定量PCR检测方法，用来检测GVE2的感染情况，发现MreB被抑制后GVE2感染效率显著下降。但这个现象只能说明GVE2的感染在总体上受到抑制，并不能反映感染的具体步骤，所以本试验进一步研究了MreB在GVE2的吸附和复制两个过程中的作用，发现在MreB被抑制的情况下，噬菌体的吸附与基因组DNA复制都受到了显著抑制，而去除抑制剂后的MreB功能回复实验表明这种抑制确实是由MreB的功能缺失引起的。本试验还通过免疫荧光标记法观察了抑制剂作用下MreB及GVE2在宿主细胞内的定位变化，结果表明MreB对GVE2感染的定位偏好性有重要作用，在正常杆状宿主菌中，GVE2倾向于感染细菌的两极，而MreB受到抑制的细胞则不存在这种噬菌体感染分布的偏好性。本试验成功构建了能在高温菌系统下稳定表达的GFP-MreB融合载体，并观察了MreB在嗜热菌E263中过表达时的分布变化，发现在过表达MreB大量积累之后，GVE2蛋白与MreB的分布出现了共定位。综上所述，高温噬菌体GVE2的感染与真核生物病毒类似，成功利用了宿主细菌的骨架蛋白MreB，在其吸附、复制过程以及感染偏好性上都与MreB建立了紧密的联系。此外，本试验还对宿主细菌的其它骨架蛋白进行了克隆，成功克隆了真核细胞中微管蛋白的原核同源蛋白FtsZ，另外在A22抑制试验中还发现MreB受到抑制后宿主细菌的泳动能力受到了一定影响。
　　 本论文围绕高温噬菌体GVE2与其宿主Geobacillussp.E263之间的相互作用展开研究，首先利用分子生物学方法对AST-GroEL-VP371之间的相互作用进行分析，并通过等温滴定量热法研究了三种蛋白互作的热动力学。其次，我们对宿主细菌骨架蛋白MreB在GVE2感染中的作用机制进行了研究，发现该蛋白在GVE2吸附、复制、以及极性偏好等感染过程中发挥着重要作用。由于噬菌体对其宿主菌的死亡率、碳循环等基本的生态过程有着重要的影响，因此本论文的研究有助于我们对极端环境生物的相互作用进行深入理解。

目录

声明

摘要

引言

1．1 高温噬菌体与宿主的相互作用

1．1．1 嗜热微生物研究进展

1．1．2 噬菌体感染机制研究

1．1．3 高温噬菌体研究进展

1．2 分子伴侣蛋白GroEL以及天冬氨酸转氨酶与噬菌体感染

1．2．1 分子伴侣GroEL概述

1．2．2 噬苗体感染与GroEL的关系

1．2．3 噬菌体感染与天冬氨酸转氨酶的关系

1．3 骨架蛋白在噬菌体感染及宿主细菌中的作用

1．3．1 细菌中的骨架蛋白

1．3．2 骨架蛋白MreB概述

1．3．2 骨架蛋白MreB在噬菌体侵染中的作用

1．4 本论文的研究目的和意义

材料与方法

2．1 材料

2．1．1 试验材料

2．1．2 菌株和质粒

2．1．3 试验试剂

2．1．4 数据分析软件

2．1．5 引物序列

2．1．6 设备与仪器

2．1．7 主要培养基与常用溶液

2．2 试验方法

结果与分析

3．1 AST-GroEL-VP371复合体在GV E2感染中的作用

3．1．1 氯化铯梯度离心法纯化高温噬菌体GVE2

3．1．2 AST、VP371与GroEL的转录及表达分析

3．1．3 AST互作蛋白的筛选

3．1．4 VP371互作蛋白的筛选

3．1．5 AST-GroEL-VP371复合体的蛋白质互作

3．1．6 AST-GroEL-VP371蛋白复合体的标记与观察

3．1．7 等温滴定量热涪(ITC)测量GroEL复合体互作热力学参数

3．2 MreB在GVE2感染中的作用

3．2．1 Geobacillus sp．E263 MreB基因的克隆表达及抗体制备

3．2．2 GVE2病毒拷贝数的定量分析

3．2．3 MreB在GVE2感染中的作用

3．2．4 A22抑制MreB对宿主菌E263泳动能力的影响

3．2．5 MreB在GVE2感染条件下的蛋白互作

3．2．6 骨架蛋白FtsZ的克隆

3．2．7 GFP-MreB融合载体构建及MreB定位分析

讨论

小结与展望

附录

致谢

参考文献