二化螟体内生物胺受体的药理学与生理学研究

摘要

昆虫体内的生物胺，主要包括章鱼胺(octopamine，OA)、酪胺(tyramine，TA)和多巴胺(dopamine，DA)等。它们在昆虫体内扮演着各种重要的生理角色，协同或各自调控着昆虫的多种行为和生理过程，如影响昆虫的产卵、昼夜节律、嗅觉、抉择、相变、好斗和飞翔以及学习和记忆等。三者的合成底物都是氨基酸酪氨酸，且酪胺是章鱼胺的合成前体。在昆虫体内，它们主要是通过结合各自特异性的G蛋白偶联受体来发挥作用。由于昆虫体内的生物胺受体一直被视为杀虫剂的潜在作用靶标，近年来，对昆虫体内生物胺，尤其是其对应受体的药理学性质和生理学功能研究日益受到关注。有鉴于此，本研究以水稻生产上的重要害虫二化螟Chilo suppressalis(鳞翅目Lepidoptera:草螟科Crambidae)为研究对象，采用分子生物学等手段对其体内的章鱼胺受体(octopamine receptors，OARs)，酪胺受体(tyramine receptos，TARs)和多巴胺受体(dopamine receptors，DARs)的药理学与生理学功能做了系统研究。
　　 1.CsOA1受体调控细胞免疫的研究
　　 本研究探索了章鱼胺对昆虫细胞免疫影响的分子机制（第二信使系统）。章鱼胺在低浓度时(＜10-6 M)能够提高二化螟幼虫血细胞的延展和吞噬能力，然而在高浓度(＞10-5 M)时却抑制血细胞的延展和吞噬反应。相应的，章鱼胺刺激血细胞能够偶联胞内两种不同的信号通路，钙离子(Ca2+)和环腺苷酸(cAMP)。在低浓度章鱼胺刺激血细胞时，其仅能提高胞内Ca2+浓度，而在高浓度章鱼胺刺激血细胞时，其既能引起Ca2+上升，又能引起胞内cAMP升高。我们在血细胞上克隆到1型章鱼胺受体(CsOA1)，通过原位杂交和免疫荧光等实验技术确定其mRNA和受体蛋白表达于二化螟血细胞上。将其异源表达于HEK-293细胞后，与章鱼胺对血细胞所引起的反应类似，CsOA1也展示出了不同浓度章鱼胺刺激可偶联两种信号通路的特性。因此，本实验支持了以前的研究，章鱼胺对昆虫先天免疫反应的激活或抑制和其胞内浓度有很大的关系。我们的结果也揭示出章鱼胺很有可能是通过结合于血细胞膜上的CsOAl受体进而偶联不同信号通路来发挥免疫功能的。生物应激反应时所产生的激素对其免疫系统有着复杂的作用，本研究所得的结果可为肾上腺素及其受体是如何参与调控脊椎动物免疫反应的研究提供参考。
　　 2.CsOA2B2受体的药理学与生理学研究
　　 从二化螟体内克隆得到一类2型章鱼胺受体(CsOA2B2)，该基因与果蝇体内的CG6989(DmOA2B2)基因同源。表达谱分析表明，该基因主要表达于二化螟幼虫神经组织中。将其表达于HEK-293细胞后，在受到章鱼胺刺激时，该受体能够偶联G。蛋白引起胞内cAMP的上升，EC50值为2.33 nM，在章鱼胺浓度为100 nM时所引起的cAMP反应最大。药理学实验表明，激动剂中naphazoline特异性大于clonidine;拮抗剂中phentolamine，mianserin和chlorpromazine能够显著拮抗章鱼胺的激动效果。用这3种拮抗剂对二化螟幼虫进行活体药理学干扰后，进行行为测定的数据表明，经mianserin和phentolamine处理的幼虫运动能力显著下降。
　　 3.一种新型章鱼胺受体CsOA3的功能研究
　　 从二化螟体内克隆得到一类孤儿受体，生物信息学分析表明其与果蝇体内的CG18208基因同源，可能属于生物胺受体家族成员。该基因通过可变剪切可产生两个剪切体，CsOA3S和CsOA3L。CsOA3L在内膜3区处比CsOA3S多了30个氨基酸，该区域可能参与了受体与G蛋白的结合。为了研究其配体信息，偶联的下游信号通路以及药理学性质，我们分别将两种剪切体真核表达于HEK-293细胞中。实验表明，两类受体均能引起胞内Ca2+的上升，而CsOA3S受体还可被章鱼胺激活引起胞内cAMP的下降，酪胺虽也可激活此类受体但特异性没有章鱼胺高。药理学实验表明,CsOA3受体可被多种激动剂激活，包括有机氮类杀虫剂杀虫脒和双甲脒等，而拮抗剂中唯有phentolamine和epinastine具有显著的拮抗效果。定量PCR实验表明，该基因主要以短剪切体CsOA3S的形式出现，并且广泛表达于各类受测组织中，其中在神经节和马氏管中表达量最高。据我们所知，CsOA3是一类新型的章鱼胺受体。
　　 4.CsTyR1受体的药理学研究
　　 从二化螟内获得一个全长cDNA，序列分析表明，其为昆虫TyR1受体家族，将其命名为CsTyR1。CsTyR1基因表达于各组织中，包括血细胞，脂肪体，中肠，马氏管，神经节和表皮，而在神经节中的表达量是其它组织的16-80倍。我们将构建的CsTyR1真核表达质粒转染于HEK-293细胞中，对其功能和药理学特性做了系统研究。结果表明，酪胺和章鱼胺能够显著降低forskolin诱导的cAMP含量，并且存在剂量效应反应(酪胺，EC50=369 nM;章鱼胺，EC50=978 nM)。结果表明，该类受体主要是偶联Gi蛋白引起胞内cAMP的下降。在受测的激动剂中,CsTyR1可被clonidine和双甲脒激活而不能被naphazoline和杀虫脒激活。拮抗剂中，酪胺的作用可被10μtM的yohimbine，phentolamine和chlorpmmazine所阻断。
　　 5.CsTyR2受体的药理学研究
　　 克隆到编码CsTyR2受体的基因全长，序列分析表明其与果蝇和家蚕体内克隆到的2型酪胺受体同源。组织分布研究发现，其主要表达于二化螟幼虫的神经节和马氏管中。将该基因表达于HEK-293细胞所做的功能试验表明，其特异性的被酪胺激活后引起胞内Ca2+的上升，EC50值约为20 nM。而另3种生物胺，章鱼胺，多巴胺和5-羟色胺在10μM浓度下刺激该受体也未见有Ca2+反应，表明该类受体是特异性的酪胺受体，且偶联Gq蛋白引起胞内Ca2+上升。所测定的4种激动剂，双甲脒、杀虫脒、clonidine和naphazoline在10μM浓度下均不能有效刺激该受体，表明该类受体与之前的章鱼胺和酪胺受体在药理学上差异甚大。
　　 6.D1-like和D2-like多巴胺受体的药理学研究
　　 从二化螟体内克隆得到3种多巴胺受体，分别命名为CsDOP1，CsDOP2和CsDOP3，其中CsDOP1和CsDOP3获得了全长序列。序列分析表明，CsDOP1和CsDOP2属于昆虫D1-like受体家族，偶联Gs蛋白引起胞内cAMP的上升,CsDOP3属于昆虫D2-like受体家族，偶联Gi蛋白引起胞内cAMP的降低。将CsDOP1和CsDOP3受体分别表达于HEK-293细胞后，对它们的药理学性质做了研究，多巴胺对两受体的激活都有明显的剂量效应(CsDOP1，EC50=20 nM; CsDOP3，EC50=670 nM)。我们测定了一系列的激动剂和拮抗剂对CsDOP1和CsDOP3受体的影响。CsDOP1中，激动剂效能大小顺序为6，7-ADTN＞多巴胺＞bromocriptine＞ pramipexole;而受测的拮抗剂中，有拮抗效果的拮抗剂，其效能大小顺序为，SCH23390＞butaclamol＞chlorpromazine＞phentolamine＞yohimbine＞propranolol＞ketanserin＞ flupenthixol＞ mianserin; CsDOP3不但偶联的信号通路与CsDOP1截然相反，它们之间的药理学性质也差异较大，激动剂bromocriptine(EC50=280 nM)的效能大于多巴胺，而拮抗剂中epinastine=mianserin＞SCH23390=chlorpromazine，其它4种拮抗剂,flupenthixol，propranolol，spiperone和butaclamol均未有显著拮抗效果。
　　 本研究从二化螟体内克隆得到3种章鱼胺受体，2种酪胺受体和3种多巴胺受体，系统性的研究了这些受体的药理学性质及其参与调控昆虫先天免疫及运动行为的分子机制。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

第一章 昆虫体内的章鱼胺和酪胺及其受体

1．引言

2．合成

3．分布

4．再摄取

5．生理功能

6．受体

6．1 信号转导

6．2 受体分类

6．3 药理学

7．展望

第二章 昆虫体内的多巴胺及其受体

1．引言

2．调控

2．1 合成

2．2 储存，释放与再吸收

2．3 降解

3．分布

4．生理功能

5．受体

5．1 信号转导

5．2 生理作用

5．3 药理学

6．展望

第三章 CsOA1受体调控细胞免疫的研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 RNA抽提

2．3 体外延展

2．4 体外吞噬

2．5 基因克隆

2．6 组织分布

2．7 荧光原位杂交

2．8 抗体制备

2．9 Western blotting

2．10 免疫细胞化学

2．11 质粒构建

2．12 细胞培养及转染

2．13 Ca2+测定

2．14 cAMP测定

2．15 免疫诱导

2．16 统计分析

3．结果与分析

3．1 OA对细胞免疫反应的影响

3．2 OA对血细胞内Ca2+反应的影响

3．3 OA对血细胞内cAMP反应的影响

3．4 CsOA1基因的克隆及序列分析

3．5 CsOA1的表达模式

3．6 CsOA1在血细胞上的表达

3．7 CsOA1受体的功能研究

3．8 免疫诱导

4．讨论

第四章 CsOA2B2受体的药理学与生理学研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 基因克隆

2．3 组织分布

2．4 质粒构建

2．5 细胞培养及转染

2．6 Ca2+测定

2．7 cAMP测定

2．8 行为学测定

2．9 统计分析

3．结果与分析

3．1 CsOA2B2基因的克隆及序列分析

3．2 CsOA2B2的表达模式

3．3 CsOA2B2的药理学性质

3．4 行为学测定结果

4．讨论

第五章 一种新型章鱼胺受体CsOA3的功能研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 基因克隆

2．3 组织分布

2．4 构建质粒

2．5 细胞培养及转染

2．6 Ca2+测定

2．7 cAMP测定

3．结果与分析

3．1 CsOA3基因的克隆及进化分析

3．2 CsOA3受体基因的分子特征

3．3 CsOA3的表达模式

3．4 cAMP测定结果

3．5 Ca2+测定结果

4．讨论

4．1 CsOA3基因的克隆及分类

4．2 CsOA3所偶联的下游信号及药理学

4．3 CsOA3受体的生理功能推测

第六章 CsTyR1受体的药理学研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 RNA抽提

2．3 基因克隆

2．4 组织分布

2．5 质粒构建

2．6 细胞培养及转染

2．7 Ca2+测定

2．8 cAMP测定

3．结果与分析

3．1 CsTyR1基因的克隆及序列分析

3．2 CsTyR1的表达模式

3．3 CsTyR1偶联胞内cAMP实验结果

3．4 CsTyR1偶联胞内Ca2+反应实验结果

4．总结

第七章 CsTyR2受体的药理学研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 RNA抽提

2．3 组织分布

2．4 基因克隆

2．5 质粒构建

2．6 细胞培养及转染

2．7 Ca2+测定

2．8 cAMP测定

3．结果与分析

3．1 CsTyR2基因的克隆及序列分析

3．2 CsTyR2的表达谱分析

3．3 Ca2+测定结果

3．4 cAMP测定结果

4．讨论

第八章 D1-like和D2-like多巴胺受体的药理学研究

1．引言

2．材料与方法

2．1 供试昆虫

2．2 RNA抽提

2．3 CsDOP1，CsDOP2和CsDOP3的基因克隆

2．4 质粒构建

2．5 细胞培养及转染

2．6 Ca2+测定

2．7 cAMP测定

3．结果与分析

3．1 CsDOP1，CsDOP2和CsDOP3基因的克隆及序列分析

3．2 CsDOP1，CsDOP2和CsDOP3的进化分析

3．3 CsDOP1的药理学解析

3．4 CsDOP3的药理学解析

4．讨论

第九章 总讨论

1．章鱼胺受体家族的药理学与生理学

2．酪胺受体家族的药理学与生理学

3．多巴胺受体家族的药理学与生理学

4．本研究创新之处

5．研究中存在的问题

6．今后的研究方向

参考文献

作者简历