NAGase作为甲壳类动物丰度指示因子的可行性研究

摘要

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-D-glucosaminidase，简称NAGase，又称壳二糖酶)参与节肢动物脱皮过程中外骨骼的消解，并在脱皮过程完成后随蜕皮液一同释放到周围水环境中，因此理论上可作为水生节肢动物生物量的指示因子。
　　论文以大型溞（Daphnia magna Straus）、裸腹溞（Moina sp.）、低额溞（Simocephalus sp.）作为受试生物，初步测定了其所释放的NAGase的动力学性质。测定结果表明三种溞所释放的酶在不超过34℃的温度下具有良好的热稳定性;酶在pH6.5-9.0的范围内其活性处于高位（即不低于最高值的75％）;大型溞所释放的酶，其水解4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D吡喃葡萄糖苷(MUF-NAG)的Km和Vm分别为0.072 mmol/L和1.28μmol/L/h。这些溞所释放的酶的Km值以及pH和温度稳定性特征与甲壳类动物体内的酶相似，与微生物、植物的酶存在一定差异。
　　以乙螨唑(eto xazole)作为受试药剂，以裸腹溞和低额溞作为受试生物，检测了农药对于NAGase体外释放量（以酶活性来衡量）和溞类繁殖量（以每雌产幼量来衡量）的影响。以酶活性作为应变量(y)，以每雌产幼量作为自变量(x)，建立两者之间的线性关系方程。对裸腹溞而言，方程的r=0.2，p=0.4;对低额溞而言，的r=0.7，p=0.08。可见低额溞比裸腹溞更符合线性关系。这主要是因为裸腹溞个体寿命短，在14d试验结束时，对照组F0的自然死亡率已达到50％。这说明NAGase释放量与繁殖率之间的线性关系存在与否，在很大程度上取决于F0在相关时段内是否始终处于存活状态。
　　以虱螨脲(lufenuron)、丁醚脲（diafenthiuron）和乙螨唑(etoxazole)作为受试农药，以大型溞、裸腹溞、低额溞作为受试生物，检测了农药对于NAGase体外释放量（以酶活性来衡量）和溞类生物量（以群体总蛋白量来衡量）的影响。以酶活性作为应变量(y)，以群体总蛋白量作为自变量(x)，建立两者之间的线性关系方程。在所开展的9项试验中，除虱螨脲对低额溞的试验组线性相关系数＜0.5，其余有8项的线性相关系数＞0.5，且丁醚脲对低额溞和裸腹溞、乙螨唑对低额溞、虱螨脲对大型溞和低额溞的实验中p值≤0.05，这说明这5项之间的正相关关系较为理想。由于已释放的酶在不断降解，新酶的释放则遵循一定的周期，测定结果受到干扰等原因，体外酶活性与受试群体的生物量的变化趋势并不总是一致。
　　检测了虱螨脲、丁醚脲、乙螨唑、氰戊菊酯、三唑酮、毒死蜱、吡蚜酮、吡虫啉、氯虫苯甲酰胺10种农药对于水中NAGase的活性的影响。离体试验的结果表明，所测的10个农药品种各自对于溞类释放的NAGase的活性影响阈值远远高于经由GENEEC模拟的其在池塘水中的最高EECs。这说明如果按照登记用量使用，残留在水中的农药，其浓度不会达到显著影响溞类所释放的NAGase的活性的水平，故其对于溞类群体生物量预测的这方面干扰基本可以因此而忽略不计。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 生态系统健康

1．1．1 水生生态系统的所谓健康

1．1．2 水生生态系统健康评价方法

1．1．3 水生生态健康评价的意义

1．2 水生浮游动物

1．3 NAGase

1．3．1 几丁质酶系

1．3．2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)

1．3．3 甲壳纲动物N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶的研究情况

1．4 农药对水生生态系统的影响

1．5 本课题的立题依据和研究内容

1．5．1 立题依据

1．5．2 主要研究内容

第二章 实验材料和方法

2．1 仪器设备

2．2 实验生物

2．3 药品与试剂

2．4 NAGase的性质的测定

2．4．1 NAGase的活性测量

2．4．2 酶源制备

2．4．3 酶的热稳定性

2．4．4 酶的酸碱稳定性

2．4．5 酶催化MUF-NAG水解的动力学参数测定

2．5 NAGase释放量与繁殖率的相关性研究

2．5．1 农药急性毒性实验

2．5．2 农药对酶释放量和溞类繁殖率影响实验

2．6 NAGase释放量与生物量的相关性研究

2．6．1 有关生物量计量方法的预实验

2．6．2 蛋白测定

2．6．3 农药急性毒性实验

2．6．4 农药对酶释放量和生物量影响实验

2．7 农药对游离NAGase的活力的影响

2．8 数据计算与统计

2．8．1 “剂量-反应”关系

2．8．2 多重比较

第三章 结果与分析

3．1 酶催化反应的动力学性质

3．1．1 酶的热稳定性

3．1．2 酶的酸碱稳定性

3．1．3 酶催化4-MUF-NAG水解的Km和Vm

3．2 NAGase释放量与繁殖率的相关性

3．3 NAGase释放量与生物量的相关性

3．3．1 有关生物量的计量方法

3．3．2 三种农药对三种溞酶活性和种群数量的影响结果

3．4 农药对溞类体外NAGase活性的影响

第四章 结论和展望

4．1 酶催反应动力学研究

4．2 乙螨唑对大型溞、裸腹溞和低额溞的14d毒性实验结果

4．3 农药对三种溞种群发育及酶释放量的影响

4．4 农药对溞类体外NAGase活性的影响

4．5 展望

参考文献

致谢