稻瘟病菌四个LIM蛋白编码基因及Gγ亚基编码基因的生物学功能研究

摘要

稻瘟病是水稻生产上的毁灭性病害之一.其病原菌-稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）通过形成分生孢子粘附于水稻表面，并在适宜条件下萌发形成附着胞进而侵染植物组织，引起稻瘟病.
　　 LIM蛋白是一类分子中含有一个或多个LIM结构域的蛋白，可调控细胞黏附、细胞运动、细胞骨架组构、细胞命运决定、器官发育、基因表达、蛋白互作和信号传导等一系列生物学功能。本研究通过生物信息学分析发现，稻瘟病菌中有4个LIM蛋白编码基因，分别命名为MoPAX1(MGG_05738)、MoLRG1(MGG_04377)、MoRGA1(MGG_04186)和MoLDP1(MGG_06198).采用基因敲除和互补策略，分别对这4个基因进行敲除和功能分析，结果表明:(1)MoPAX1或MoLRG1基因敲除均导致稻瘟病菌致病能力丧失，且突变体的营养生长极其缓慢;(2) MoPAX1基因敲除突变体完全丧失产孢能力，MoLRG1基因敲除突变体只产生极少量的畸形孢子，而MoRGA1敲除突变体产生大量的长形孢子;(3) MoPAX1和MoLRG1基因敲除突变体均不能在人工疏水表面和植物组织表面形成附着胞，MoRGA1基因敲除突变体在人工疏水表面的附着胞形成严重减少，而在植物组织表面能正常形成附着胞并穿透表皮组织;(4) MoLDP1基因敲除突变体无明显的表型改变;(5)所有基因敲除突变体的表型缺陷均能通过相应基因互补而得以恢复或部分恢复;(6)通过GFP融合表达及蛋白定位分析，发现MoLrg1和MoRga1蛋白均定位于细胞的隔膜孔，而MoPax1蛋白的表达分布于整个细胞基质;(7)结构域缺失实验表明，MoLrg1的LIM2(第2个LIM结构域)和RhoGAP结构域是蛋白行使功能和定位所必需的，而LIM1（第1个LIM结构域）只与MoLrg1蛋白的胞内定位相关。缺失MoPax1中3个LIM结构域的任何一个均不影响该蛋白的功能，但3个LIM同时缺失影响蛋白功能和胞内定位;(8)基因转录表达谱分析表明，MoLrg1、MoPax1和MoLdb1在基因表达、代谢调控和蛋白互作方面存在较高的相似性。综上所述，LIM蛋白-MoLrg1和MoPax1在调控稻瘟病菌营养生长、形态分化和致病性等方面均具有重要的生物学功能.
　　 此外，我们先前通过T-DNA插入突变的方法鉴定到了一个稻瘟病菌Gγ亚基失活的突变体A1-412，该突变体在产孢、附着胞分化和致病性方面均存在缺陷.本研究进一步用基因敲除的方法阐明Gγ亚基编码基因MGG1的功能，并分析了Mgg1蛋白的细胞定位，取得以下结果:(1)稻瘟病菌MGG1基因敲除突变体的产孢量显著下降，仅为野生菌株的1/10;(2)MGG1基因敲除突变体的孢子萌发率明显降低，在疏水表面培养6h和24h后分别仅有约13％和57％的孢子萌发，而野生菌株6h的萌发率即可超过90％;(3)MGG1基因敲除菌株在疏水表面处理24h仍不能形成附着胞，而野生菌株处理6h时附着胞形成率已超过80％。通过添加外源的cAMP和IBMX，MGG1敲除菌株分生孢子的萌发和附着胞形成均可部分恢复，但形成的附着胞不能穿透植物表皮;(4) MGG1基因敲除菌株与亲和菌株TH3进行有性生殖仅产生极少量的子囊壳;(5)MGG1基因敲除突变体在大麦和水稻叶片上均丧失了致病性;(6)基因互补实验结果表明，MGG1基因敲除菌株的产孢、萌发、附着胞形成及致病性均恢复至野生菌株Guy11水平;(7)蛋白亚细胞定位研究表明，Mgg1蛋白定位于菌丝、分生孢子和附着胞的细胞膜上。综上所述，稻瘟病菌Gγ亚基在调控分生孢子形成、孢子萌发、有性生殖、附着胞分化及致病性等方面具有重要的生物学功能。

目录

声明

致谢

摘要

缩略表

第一章 文献综述

1 稻瘟病及稻瘟病菌概述

1．1 稻瘟病的发生规律与防治

1．2 稻瘟病菌的侵染机制

2 稻瘟病菌分子生物学研究进展

2．1 稻瘟病菌基因组主要特征

2．2 G蛋白信号途径

2．3 cAMP-PKA信号途径

2．4 Pmk1 MAPK信号途径

2．5 Ca2+信号途径

2．6 黑色素合成与膨压形成机制

2．7 海藻糖合成途径

2．8 稻瘟病菌回避植物防御反应的机制

2．9 稻瘟病菌侵染过程中的细胞骨架动力学

2．10 稻瘟病菌抗氧化胁迫机制

3 LIM蛋白研究进展

3．1 LIM结构域的发现与结构

3．2 LIM蛋白的多样性及分类

3．3 LIM蛋白的主要功能

3．4 真菌LIM蛋白的研究进展

4 本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

1 材料和试剂

1．1 供试菌株、质粒载体及寄主品种

1．2 培养基、抗生素及工具酶使用

2 常规分子生物学实验操作

2．1 PCR

2．2 核酸电泳

2．3 DNA抽提、酶解、回收及连接

2．4 RNA抽提及qRT-PCR

2．5 DNA转化

2．6 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交(DIG)

2．7 酵母双杂交实验

3 稻瘟病菌生物学性状测定实验

3．1 稻瘟病菌生长速度测定及菌落形态观察

3．2 稻瘟病菌产孢培养和产孢量测定

3．3 稻瘟病菌分生孢子诱导及侧拍实验

3．4 附着胞形成实验

3．5 稻瘟菌有性生殖实验

3．6 稻瘟菌单孢分离实验

3．7 大麦高体接种和水稻喷雾接种

3．8 水稻幼根接种实验

3．9 洋葱表皮穿透实验

3．10 稻瘟病菌菌丝、分生孢子和附着胞的GFP观察

3．11 稻瘟病菌细胞壁敏感性测定

第三章 结果与分析

1 稻瘟病菌四个LIM蛋白编码基因的功能分析

1．1 稻瘟病菌四个LIM蛋白编码基因的鉴定与同源性分析

1．2 稻瘟病菌四个LIM蛋白编码基因的敲除与互补

1．3 稻瘟病菌四个LIM蛋白编码基因敲除的表型分析

1．4 稻瘟病菌LIM蛋白的亚细胞定位

1．5 MoLrg1和MoPax1蛋白结构域功能分析

1．6 稻瘟病菌MoLdb1和LIM蛋白的互作关系

1．7 稻瘟病菌MoPax1、MoLrg1及MoRga1互作蛋白检测

1．8 稻瘟病菌其它六个含RhoGAP蛋白的基因敲除及表型初步分析

2 稻瘟病菌Gγ亚基编码基因MGG1生物学功能分析

2．1 Gγ亚基编码基因MGG1序列分析

2．2 Gγ亚基编码基因MGG1的敲除及互补

2．3 Gγ亚基编码基因MGG1敲除菌株的表型分析

2．4 稻瘟病菌Gγ亚基的细胞定位

第四章 全文总结、讨论与展望

1 全文总结

2 讨论及展望

2．1 LIM蛋白的同源性及一致性分析

2．2 稻瘟病菌的基因敲除效率

2．3 突变体Δmopax1和Δmolrg1的表型互补

2．4 稻瘟病菌MoPax1及其同源蛋白功能比较

2．5 Lrg1和Rga1蛋白功能比较

2．6 MGG1插入失活与敲除突变分析

2．7 未来研究展望

参考文献

附录1 本文的突变体及野生菌株

附录2 本文的引物信息

附录3 作者简历及在学期间取得的科研成果