苍术属系统发育及药用植物白术的群体遗传和栽培起源研究

摘要

苍术属(Atractylodes DC)是东亚特有的菊科(Asteraceae)小属，为多年生草本。属内除鄂西苍术根茎不膨大不做药用外，其余各种均有地下不规则膨大或结节状根状茎入药，是药材白术和苍术的基源植物。药用植物白术(Atractylodesmacrocephala Koidz.)是苍术属植物，为我国特产，其根茎素有“北参南术”之美誉，是著名中药材“浙八味”之一。随着中药标准化进程的推进，药用植物的种质鉴定和栽培研究也受到了越来越多的关注。本研究基于nrITS，18 S-ETS和cpDNA序列构建了苍术属的系统发育树，结合形态学证据，探讨了苍术属的系统发育关系。结合cpDNA序列变异和核SSR分子标记研究了药用植物白术的遗传多样性和群体遗传结构，探讨了白术的栽培起源。检验了不同的DNA条形码在苍术属植物中的鉴定能力，并对白术的分子鉴别进行了进一步的研究。主要研究内容及结果如下：
　　⑴苍术属的系统发育。通过叶绿体片段（trnL-trnF、ndhJ-trnF、trnD-psbM和psbE-petL）和核核糖体RNA基因片段（ITS和18S-ETS）研究了苍术属的系统发育（包括分布中国、韩国和日本的苍术属植物，共5个种、1个亚种和1个栽培类群，共计79个样本）。基于叶绿体序列和核基因片段的系统发育分析均表明，苍术属中的鄂西苍术(A.carlinoides)和白术(A.macrocephala)是很好的单系类群。揭示关苍术(A.japonica)、苍术(A.lancea)和朝鲜苍术（A.coreana）的叶绿体基因组存在祖先的多态性保留以及不完全谱系分选现象，而核基因片段能够更好的反映该属的系统发育关系。基于核基因以及叶绿体和核基因联合分析的结果均表明，苍术、关苍术、朝鲜苍术以及栽培类群‘平术’（Atractylodes‘Pingzhu’）的系统发育关系均能得到很好的解决;其中苍术很明显的分为中国南方和北方两大分支，而朝鲜苍术嵌在中国北方分支中，且不形成单系;关苍术是一个单系，且没有表现出明显的中国-韩国-日本间断分布的地域性特征，是苍术属内遗传变异最为丰富的类群;揭示了白术的栽培类群‘平术’的独特性，和白术一起构成的分支在3种构树方法(MP、ML、Bayesian推断)上均得到最大支持。
　　⑵微卫星标记的开发与筛选。采用双重抑制PCR法开发了15对具有多态性的微卫星引物。挑选了4个群体83个个体对15对微卫星位点进行扫描和特征分析，结果显示，15个微卫星位点在4个群体中的观测等位基因数目(Na)为2-20不等，平均为9.9;观测杂合度（Ho）的范围为0.083-1.000，平均值为0.549;期望杂合度（He）的范围为0.097-0.938，平均值为0.657。这15对能够稳定扩增，且具有多态性的白术微卫星引物适用于该药用植物后续的群体遗传和栽培起源研究。
　　⑶栽培白术的起源。基于cpDNA和SSR分子标记的研究揭示，白术在栽培过程中并没有和其它栽培作物一样丧失遗传多样性，这与其种子繁殖和相对较短的栽培历史有关。另外，由于群体的大规模引种和人为介导的种子流，加上野生群体的丧失，导致基于核SSR分子标记的遗传多样性略高于野生群体。研究揭示，在栽培和野生群体中，白术的遗传变异大部分存在于群体内个体间，而群体间的遗传分化很小，野生群体群体间的遗传变异大于栽培群体群体间的遗传变异(cpDNA:52.85％ vs3.12％;SSR分子标记:12.46％ vs4.56％)。基于8个核SSR分子标记的STRUCTURE和UPGMA树分析结果揭示，除栽培类群‘平术’外的白术群体可以分为3个Group。栽培白术归入其中的2个Group，并且分别具有其野生的共祖群体，揭示现有的栽培白术可能有2次独立的起源。传统浙江产区的栽培白术可能来源于中国中西部，而传统湖南、江西、湖北三省交界处产区的栽培群体就来源于当地的野生群体。基于BAYESASS的当代基因流的分析结果反映这两个Group的最早引种栽培地可能分别是浙江天台和湖南桑植。而第3个Group仅包含安徽祁门的野生群体(W1)，且该群体在cpDNA和核基因上均表现出其独特性，应该没有参与白术的栽培过程，揭示了野生地方品种‘祁术’的存在。
　　⑷浙江白术的道地性和候选野生群体。在栽培白术中，浙江群体聚到了一支，表明了浙江栽培白术道地性的遗传基础。在野生白术中，部分群体尤其是分布于安徽祁门的野生白术品种‘祁术’，拥有丰富的遗传多样性，不管是epDNA还是核基因水平，都展现出其特殊的群体结构，是种质遗传改良的重要资源库，可以为白术的栽培育种提供候选材料。
　　⑸苍术属DNA条形码及白术种质的分子鉴别研究。DNA条形码(DNA bareoding)技术是近年来发展起来的利用短的DNA片段对生物物种进行识别和鉴定的一种新的分子生物学技术，可以通过该技术对物种进行快速鉴定，从而克服传统分类学研究方法中的一些不足。以核心条形码叶绿体片段rbcL和matK，以及辅助条形码psbA-trnH和核核糖体ITS等4个DNA片段作为标记，对苍术属5个种(A.carlinoids， A.macrocephala,A.lancea,A.chinensis，A.japonica)，1个变种(A.chinensis var.coreana)，共计20个个体进行了分子鉴别研究。用Wilcoxon signed rank tests检测了条形码种间和种内遗传差异，结果表明种间差异ITS＞＞psbA-trnH＞＞matK＞＞rbcL，种内差异ITS=psbA-trnH＞＞matK＞＞rbcL。单片段及组合片段构建的系统发育树显示单片段ITS和包含ITS的组合片段rbcL+matK+ITS具有最高的鉴别能力，而单片段ITS就可以鉴别5个种。A.chinensis和其变种A.chinensis var.coreana在条形码研究中也分不开，由此进一步证明两者之间分化不完全。因此，从节约成本和实验效率的角度考虑，我们建议将ITS单片段用于苍术属的物种鉴别。另外本研究还采用叶绿体DNA rbcL、matK、psbA-trnH、trnL-trnF、psbE-petL和nrITS组合片段，对我国10个主要白术群体（30个个体）进行了分子鉴别研究。结果显示栽培白术和安徽祁门的野生白术之间已经产生较大分化，而栽培白术群体间因人为介导的基因流的作用而分化不明显。
　　⑹苍术属的分类学修订建议。综合分子系统学、条形码和形态学的研究结果认为，苍术属中的鄂西苍术(A.carlinoides)和白术(A.macrocephala)是很好的单系类群;叶绿体和核基因以及形态学分析均表明关苍术是一个单系类群，是一个广布东北亚的‘好种’，表现出典型的异域物种形成模式;综合分子系统学结果和地理分布模式，苍术（A.lancea）可以明显的分为中国南方和北方两个谱系，认为中国南方分布的分支是一个独立的种即苍术(A.lancea)，并且Koidzumi将中国北方谱系的苍术作为种处理是合理的，即北苍术A.chinensis(Bunge) Koidz.;朝鲜苍术(A.coreana)嵌在苍术中国北方分支中，且形态学的研究结果也和北苍术难以分开，可能是适应干燥山坡的一种生态型，建议将其作为北苍术下的变种处理，即A.chinensis(Bunge) Koidz.var.coreana;结合形态、分子和实际生产中的应用，建议将栽培类群‘平术’作为白术种下的一个栽培品种处理，即白术栽培品种‘平术’(A.macrocephala‘Pingzhu’)。

目录

论文说明

声明

缩略词表 Abbreviation

摘要

第一章 前言

1．1 植物分子系统学与群体遗传学研究

1．1．1 植物分子系统学研究

1．1．2 植物群体遗传学研究

1．2 栽培物种驯化历史研究

1．3 微卫星的原理和引物开发技术

1．3．1 微卫星的原理

1．3．2 微卫星引物开发方法

1．4 苍术属国内外研究现状

1．4．1 属种研究概况

1．4．2 药用植物苍术和白术的来源和鉴定

1．5 药用植物白术的研究现状

1．5．1 概况

1．5．2 白术的栽培历史及现状

1．5．3 白术的药用历史、化学成分及药理学研究

1．5．4 遗传多样性研究

1．6 本研究的目的、意义和内容

1．6．1 研究的目的和意义

1．6．2 研究内容

第二章 苍术属系统发育研究

2．1 材料与方法

2．1．1 文献和标本查阅

2．1．2 野外调查和取样

2．1．3 形态性状分析

2．1．4 系统发育分析

2．2 结果

2．2．1 野外调查及物种的初步确定

2．2．2 形态学证据

2．2．3 分子系统学证据

2．3 讨论

2．3．1 苍术属的系统发育关系

2．3．2 苍术的种下分类问题

2．3．3 朝鲜苍术的分类学位置

2．3．4 栽培类群‘平术’的分类学处理

2．3．5 药材白术和苍术基源植物划分的遗传基础及关苍术的地位

2．4 小结

第三章 药用植物白术微卫星引物开发

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 仪器、试剂及来源

3．1．3 DNA提取

3．1．4 微卫星富集文库的构建、测序及引物设计

3．1．5 微卫星引物设计

3．1．6 PCR引物效率检测

3．1．7 微卫星位点的多态性检测

3．2 结果

3．3 数据分析及讨论

第四章 基于cpDNA单倍型和核SSR标记的白术群体遗传及栽培起源研究

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果分析

4．2．1 cpDNA结果分析

4．2．2 SSR结果分析

4．2 讨论

4．2．1 栽培类群‘平术’的遗传多样性

4．2．2 白术叶绿体和核基因水平上的遗传多样性和遗传分化

4．2．3 白术的栽培起源与群体动态历史

4．2．4 白术的栽培育种与野生群体的保护

4．3 小结

第五章 苍术属DNA条形码及白术种质的分子鉴别研究

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．3 结果与分析

5．3．1 苍术属物种界限

5．3．2 白术种内的分子鉴定

5．4 讨论

5．4．1 DNA条形码在苍术属中的物种鉴别能力

5．4．2 白术的分子鉴定研究

5．5 小结

第六章 总结与展望

6．1 总结

6．2 展望

参考文献

附录

在读期间的主要成果

致谢