罗氏沼虾中性别发育相关基因Sxl和Dmrt基因的分子特征和功能研究

摘要

罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergii）是一种重要的淡水经济虾类，广泛分布在热带及亚热带地区。该虾生长快，个体大且食性杂，具有很高的经济价值。目前有关罗氏沼虾的育种和养殖技术都有了长足的进步，但是对潜藏在雌雄个体的性别两态性下的分子机制知之甚少。本研究以罗氏沼虾为研究对象，从动物保守性别决定核心途径中选取了两种最为重要的关键基因Sxl和Dmrt，开展了结构解析及其在沼虾性别发育和生殖中重要作用的相关研究。
　　 第一部分，罗氏沼虾Sxl基因的分子结构解析和功能分析。
　　 首先，通过简并PCR的方法克隆得到了一个Sxl的片段，以这个片段为探针，筛选罗氏沼虾的神经节cDNA文库并测序，通过比对分析得到了四个异构体。基因全长分别为2054、1977、1897和1031bp，依次命名为MroSxl1、MroSxl2、MroSxl3和MroSxl4。Northernblotting和异构体特异性的RT-PCR的结果都证明了这四个异构体在罗氏沼虾中的确实存在。采用Southernblotting的方法研究Sxl在基因组的拷贝情况，结果表明MroSxl基因在罗氏沼虾的基因组中只存在一个拷贝形式。
　　 其次，通过异构体特异性RT-PCR和Westernblotting在雌雄个体中检测四种异构体是否存在着雌雄差异性，RT-PCR结果表明四种MroSxl异构体在雌雄个体中同时存在，Westernblotting的结果也证明了在蛋白水平上MroSXL在雌雄虾中都有表达，不存在性别特异性表达的MroSXL。其中MroSXL3/4在雌虾的神经节、肝胰脏和卵巢中特异性的高量表达。进一步对雌雄虾生殖腺的免疫组化证明:在雄虾精巢中该蛋白主要在精原细胞中表达，在精子中没有表达;在雌虾卵巢的卵子发生早期SXL蛋白主要在细胞质中表达，随着卵母细胞进入到卵黄发生阶段，蛋白主要集中在细胞核中。
　　 第二部分，罗氏沼虾Dmrt基因的分子结构解析和功能分析。
　　 首先，我们通过简并PCR和RACE的克隆方法得到了两个Dmrt基因，一个基因全长2073bp，包含了一个1614bp的开放阅读框，编码形成一个537aa的蛋白;另一个基因全长906bp，包含了一个618bp的开放阅读框，编码形成一个205aa的蛋白，通过对氨基酸序列的分析证明都包含了Dmrt家族特有的DM结构域——一个特殊的锌指结构。通过系统进化关系分析发现这两个基因分别属于Dmrt11E和Dmrt99B分支，因此分别命名为MroDmrt11E和MroDmrt99B。
　　 其次，采用半定量RT-PCR的方法研究这两个基因在mRNA水平上的表达特征，结果表明罗氏沼虾中两个MroDmrt基因都表现出了明显的性别特异性:MroDmrt11E主要在精巢中有高量表达，在两性的神经节中有一定程度的表达，在卵巢表达极低（少于精巢的1/10，P＜0.01）;而MroDmrt99B特异性的表达在精巢中且表达量较低。在胚胎发育过程中，两个基因都呈现随着胚胎发育的进行表达量随之升高，相对的MroDmrt99B有一个滞后性。
　　 这些结果揭示了核心性别决定机制在甲壳类中的保守性和特殊性，为阐明经济虾蟹类为代表的甲壳类性别分化和调控分子机制提供了重要证据，为进一步应用于水产养殖中的性别人工控制提供了重要理论依据。

目录

声明

前言

摘要

插图和附表清单

常用缩略词

第一章 绪论

1．研究背景

1．1 罗氏沼虾简介

1．2 Sxl在性别发育过程中的作用

1．3 Dmrt在性别发育中的作用

1．4 研究目的、方法、意义

第二章 罗氏沼虾性别关键基因Sxl基因的分子特征

1．引言

2．材料和仪器

2．1 实验材料

2．2 实验试剂

2．3 主要仪器

3．方法

3．1 罗氏沼虾胚胎样品和成熟雌雄生殖腺的RNA抽提

3．2 cDNA模板的合成

3．3 MroSxl基因RRM结构域部分片段的获得

3．4 MroSxl基因四个异构体的获得

3．5 Northem blotting

3．6 Rr-PCR

3．7 Southern blotting

3．8 MroSxl基因组序列的获得和分析

3．9 MroSXL进行系统进化分析

3．10 筛选克隆测序，PCR产物测序

4．结果

4．1 MroSxl基因四个异构体的序列分析

4．2 MroSxl的基因组分析

4．3 MroSxl的进化关系

5．讨论

第三章 罗氏沼虾MroSxl基因的功能分析

1．引言

2．材料和仪器

2．1 实验材料

2．2 实验试剂

2．3 主要仪器

3．方法

3．1 MroSxl的定量PCR

3．2 MroSxl的RT PCR／Souther blotting

3．3 Western blotting

3．4 MroSxl在罗氏沼虾中的体内干涉

3．5 免疫组化

4．结果

4．1 MroSxl异构体的雌雄性别特异性检测

4．2 MroSxl基因的组织特异性分布

4．3 MroSxl基因在胚胎发育过程的表达分析

4．4 MroSXL蛋白在雌雄虾生殖腺的表达定位

5．讨论

第四章 罗氏沼虾中性别相关基因Dmrt的分子特征

1．引言

2．材料和仪器

2．1 实验材料

2．2 实验试剂

2．3 主要仪器

3．方法

3．1 胚胎时期总RNA的抽提和cDNA的合成

3．2 MroDmrt基因的获得

4．结果

4．1 两个MroDmrt基因的获得和序列特征分析

4．2 DM结构域的特征分析

4．3 MroDMRT在DMRT家族中的系统进化关系

5．结论

第五章 罗氏沼虾中MroDmrt基因的表达和功能分析

1．引言

2．材料和仪器

2．1 实验材料

2．2 实验试剂

2．3 主要仪器

3．方法

3．1 取样，抽提总RNA，合成cDNAs

3．2 半定量RT-PCR

3．3 MroDmrt在罗氏沼虾中的体内干涉

4．结果

4．1 MroDmrt基因的表达特征

4．2 MroDmrt的功能分析

5．讨论

结论与展望

创新点

参考文献

附录一 常用试剂配制一览表

附录二 攻读博士期间的科研成果

致谢