拟南芥中调控表皮毛发育的GIS家族基因GIS、GIS2和ZFP8下游基因的筛选与鉴定

摘要

拟南芥表皮毛的发育调控可以提供了一个简单的模型来研究细胞命运决定和形态建成。近几年，拟南芥表皮毛发育的分子调控机制的研究取得了很大进展，已克隆出大量的控制表皮毛不同发育阶段的基因，通过对这些基因的功能解析揭示出表皮毛发育及生长调节的内在分子机制。我们以往的研究发现GIS和它的两个同源基因ZFP8与GIS2通过整合赤霉素和细胞分裂素信号控制拟南芥表皮细胞形成和发育。GIS、GIS2和ZFP8这三个基因都是调控表皮毛的发育的正向调控基因，但它们在响应赤霉素和细胞分裂素的信号途径调控表皮毛细胞形成方面有着独特的角色，比如本研究发现GIS与SIM基因互作调控拟南芥表皮毛分支细胞的形成。本研究主要利用突变体、Dex-诱导过量表达为材料，通过基因芯片技术，分析比较各种基因在gis、gis2、zfp8突变体、双突变体gisgis2、gisgis2ZFP8RNAi株系、野生型及Dex（Dexamethasone）诱导GIS、 GIS2和ZFP8过量表达和无Dex诱导对照下的表达水平，筛选出GIS、GIS2的候选靶基因和ZFP8的下游功能基因。通过GO分类对基因进行功能注释，利用q-PCR结果筛选出一些候选靶基因，最后用地塞米松和放线菌酮诱导实验和染色体免疫共沉淀技术，确定了GIS和GIS2的直接作用靶点。主要研究结果如下: 1)筛选出176个参与GIS调控途径的下游基因，通过q-PCR检测了其中的转录因子和差异最显著的40条基因在突变体gis和GIS过量表达株系中的相对表达量，挑选出9条基因作为GIS的候选靶基因，利用地塞米松和放线菌酮诱导实验和染色体免疫共沉淀技术，我们从9条候选基因中确定了At3g04720(PR-4)、At2g05160和At3g57920(SPL15)为GIS的直接作用靶基因，通过激素处理实验，发现这三个靶基因均受赤霉素诱导。 2)筛选出142个参与GIS2调控途径的下游基因，通过q-PCR检测了其中的9个转录因子和差异最显著的40条基因在突变体gis2和GIS2过量表达株系中的相对表达量，挑选出7条GIS2的候选靶基因，利用地塞米松和放线菌酮诱导实验和染色体免疫共沉淀技术，从候选靶基因中筛选出GIS2的两个靶基因At5g24150(SQE5)和At4g35770(SEN1)，激素诱导实验显示At5g24150(SQES)受GA诱导。 3)筛选出138个参与ZFP8调控途径的下游基因，利用q-PCR结果筛选出受ZFP8主要调控的下游基因，并找出了一些受ZFP8调控的转录因子，通过比较分析GIS、GIS2和ZFP8调控的下游基因，发现它们的交集很少，但是GO分类分析结果显示它们下游基因的功能相似，通过分析双突变体gisgis2和三突变体gisgis2ZFP8RNAi株系的差异表达基因，发现GIS、GIS2和ZFP8可能参与植物对胁迫刺激的响应过程。 以上研究结果有助于我们深入了解GIS家族基因通过植物激素调控表皮毛形成的分子作用机制，同时这项研究对于完善植物表皮毛基因调控网络具有重要的学术意义，GIS、GIS2、ZFP8及它们的下游基因的克隆和鉴定可以为改良作物抗逆性，提高作物产量和分子育种，提供重要的新的基因资源。

目录

声明

致谢

摘要

图一览表

表一览表

缩略语表

第一章 文献综述

1 拟南芥表皮毛的发育

1．1 拟南芥表皮毛发育的不同阶段

1．2 调控拟南芥表皮毛发育启动的关键基因

2 拟南芥表皮细胞分化的调节模型

2．1 拟南芥表皮毛发育的两种理论模型

2．2 拟南芥表皮毛细胞命运决定的模式

3 植物C2H2型锌指蛋白的研究进展

3．1 植物C2H2型锌指蛋白的分类

3．2 植物C2H2型锌指蛋白的结构与功能

3．3 与植物表皮毛形成有关的C2H2型锌指蛋白

4 本研究的目的和意义

第二章 GIS与SIM基因互作调控拟南芥表皮毛分支数性状

1 材料与方法

1．1 植物材料和生长条件

1．2 双突变体的构建

1．3 基因克隆与载体构建

1．4 RNA提取与实时荧光定量PCR

1．5 统计分析方法

2 结果分析

2．1 SIM基因的敲除影响GIS基因的表达

2．2 通过冷冻扫描电镜图发现GIS抑制拟南芥表皮毛产生分支

2．3 通过对表皮毛分支数的统计说明GIS间接调控表皮毛的分支

3 讨论

第三章 拟南芥C2H2型锌指蛋白GIS靶基因的鉴定

1 材料与方法

1．1 植物材料和生长条件

1．2 基因克隆与载体构建

1．3 RNA的提取及拟南芥表达谱芯片分析

1．4 RNA提取与实时荧光定量PCR

1．5 DEX诱导GIS的表达

1．6 赤霉素处理实验

1．7 染色体免疫共沉淀

1．8 Western Blot

2 结果分析

2．1 GIS在pOp6／LhGR系统下的表达

2．2 通过基因芯片数据分析筛选参与GIS基因调控途径的下游基因

2．3 对筛选出的GIS下游基因进行q-PCR验证

2．4 176个基因中转录因子的分析

2．5 利用Dex和放线菌酮处理实验筛选GIS的候选靶基因

2．6 At3g04720、At2g05160和At3g57920是GIS的靶基因

2．7 GIS和下游靶基因受GA诱导

3 讨论

第四章 拟南芥C2H2型锌指蛋白GIS2靶基因的鉴定

1 材料与方法

1．1 植物材料和生长条件

1．2 基因克隆与载体构建

1．3 RNA的提取及拟南芥表达谱芯片分析

1．4 RNA提取与实时荧光定量PCR

1．5 DEX诱导GIS2的表达

1．6 赤霉素处理实验

1．7 染色体免疫共沉淀和Western Blot

2 结果分析

2．1 GIS2在pOp6／LhGR系统下的表达

2．2 通过基因芯片数据分析筛选参与GIS2调控途径的下游基因

2．3 对筛选出的GIS2的下游基因进行q-PCR验证

2．4 142个基因中转录因子的分析

2．5 利用Dex和放线菌酮处理实验筛选GIS2的候选靶基因

2．6 ChIP结果显示GIS2与At5g24150和At4g35770的启动子结合

2．7 GIS2和下游靶基因受GA诱导

3 讨论

第五章 拟南芥中C2H2型锌指蛋白ZFP8下游基因的鉴定

1 材料与方法

1．1 植物材料和生长的条件

1．2 基因克隆与载体构建

1．3 RNA的提取及拟南芥表达谱芯片分析

1．4 RNA提取与实时荧光定量PCR

1．5 DEX诱导ZFP8的表达

2 结果分析

2．1 ZFP8在pOp6／LhGR系统下的表达

2．2 通过基因芯片数据分析筛选参与ZFP8调控途径的下游基因

2．3 对筛选出的ZFP8的下游基因进行q-PCR验证

2．4 138个基因中转录因子的分析

2．5 ZFP8主要调控的基因参与生物过程的功能分析

3 讨论

第六章 GIS、GIS2和ZFP8的下游基因与gisgis2双突变体和gisgis2ZFP8RNAi的差异基因的比较与功能分析

1 材料与方法

1．1 植物材料和生长条件

1．2 gisgis2双突变体和gisgis2ZFP8RNAi line的构建

1．3 拟南芥表达谱芯片分析

1．4 统计分析方法

2 结果分析

2．1 双突变体gisgis2中的差异基因与GTS和GIS2的下游基因的分析比较

2．2 gisgis2ZFP8RNAi line中的差异基因与GIS、GIS2和ZFP8的下游基因的分析比较

3 结论与展望

参考文献

攻读博士学位期间取得的研究成果