合欢皮皂苷对猪伪狂犬病疫苗的佐剂活性及解毒作用

摘要

猪伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒及急性脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。伪狂犬病病毒感染猪会引起种猪的繁殖障碍，妊娠母猪流产、产死胎、木乃伊胎等，15日龄内的仔猪死亡率达100％。伪狂犬病给全球养猪业造成了巨大的经济损失，为当前危害养猪业的重大传染病之一。疫苗是预防伪狂犬病发生和传播的主要有效措施。然而，目前临床上使用的猪伪狂犬病疫苗免疫保护率欠佳。添加佐剂是当前强化疫苗免疫效果不可或缺的手段。
　　AJS(Albizziajulibrissin saponin)系从中药传统合欢皮中筛选得到的佐剂活性皂苷有效部位，对卵清蛋白(OVA)、禽流感鸡痘病毒载体活疫苗和禽流感-新城疫重组二联活疫苗等均具有显著的佐剂作用，且溶血性小，安全性高，是一种理想的疫苗候选佐剂。同时，前期实验发现AJS可显著降低猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗对小鼠的毒性。本文评价了AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂活性，并研究了AJS降低猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗对小鼠毒性的作用，为基于AJS佐剂的猪伪狂犬病疫苗研制与开发提供依据。
　　1.AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂作用采用ICR小鼠，在摸索猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫剂量的基础上，以铝胶(Alum)和Quil A为佐剂对照，猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合不同剂量的AJS(25、50、100μg)皮下注射免疫小鼠二次，间隔2周，加强免疫后14天，取血，分离制备血清。采用IDEXX猪伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒检测了免疫小鼠血清中猪伪狂犬病病毒gB抗体（PRV gB Ab）水平，以及间接ELISA方法分析猪伪狂犬病病毒gB特异性IgG总抗体及其亚类IgG1和IgG2b的水平，评价AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂作用。结果表明:AJS可显著提高猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠血清中PRV gB抗体水平，以及猪伪狂犬病病毒gB特异性IgG、IgG1、IgG2b抗体水平。说明AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗有显著的佐剂作用。这些结果为AJS作为猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的佐剂进行临床实验和推广应用奠定了基础。
　　2.AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗的解毒作用采用AJS处理猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗、猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合AJS免疫小鼠脑组织感染Vero细胞，通过观察细胞病变(CPE)，研究了AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗引起小鼠毒性的影响。采用RT-PCR法检测AJS处理猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗感染Vero细胞、猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合AJS免疫小鼠脑组织感染Vero细胞，以及猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独或联合AJS免疫小鼠脑组织中猪伪狂犬病病毒基因组DNA及毒力基因的表达变化。猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠体内病毒定位分析结果显示:仅脑组织感染的Vero细胞发生典型的细胞病变，说明该病毒仅定位于免疫小鼠的脑组织。体内和离体实验结果表明，仅猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗单独免疫小鼠脑组织及其感染的Vero细胞检测到猪伪狂犬病病毒基因组DNA及毒力基因的表达。体外结果表明:在AJS对PrV的杀灭浓度范围内，AJS对猪伪狂犬病病毒感染Vero细胞gB、gD、gG等蛋白的表达无显著影响，但能显著降低毒力基因TK、pK、gI及gC的表达水平，且呈剂量依赖性。这些结果说明:AJS可通过下调猪伪狂犬病病毒毒力基因的mRNA表达，降低猪伪狂犬病病毒的毒力，从而发挥解毒作用。研究为AJS作为抗病毒药物开发及为基于AJS佐剂的猪伪狂犬病疫苗的研制与开发提供了依据。

目录

声明

摘要

主要缩略词

第一章 综述

1 猪伪狂犬病

1．1 病原学

1．2 流行病学

1．3 临床症状

2 猪伪狂犬病的流行情况

2．1 国内流行情况

2．2 国内疫苗使用情况

3 合欢皮皂苷的国内外研究进展

第二章 合欢皮皂苷AJS对猪伪狂犬病活疫苗的佐剂活性

1 材料与仪器

1．1 仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 供试药物

1．4 供试疫苗

1．5 实验动物

2 实验方法

2．1 疫苗免疫剂量摸索

2．2 免疫程序

2．3 血清中PrV特异性gB抗体效价测定

2．4 间接ELISA方法检测血清中gB特异性IgG及其亚类IgG1、IgG2b抗体水平

2．5 统计学分析

3 结果与分析

3．1 免疫剂量的确定

3．2 对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠血清中PrV特异性gB抗体效价的影响

3．3 对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠血清中gB特异性抗体及其亚类效价的影响

3．4 AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗引起小鼠致死性的影响

4 讨论

第三章 合欢皮皂苷AJS对猪伪狂犬病活疫苗的解毒作用

材料与方法

1．1 仪器设备

1．2 主要试剂

1．3 供试药物

1．4 供试疫苗

1．5 实验动物

1．6 细胞株

2 实验方法

2．1 AJS对PrV在小鼠体内分布和增殖的影响

2．2 AJS对PrV体外抗病毒作用

2．3 RT-PCR检测AJS对Prv增殖和相关基因表达的影响

3 结果与分析

3．1 猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠组织中PrV的定位

3．2 AJS对猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠脑组织中PrV的影响

3．3 PrV在AJS联合猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗免疫小鼠体内的组织定位

3．4 AJS对Vero细胞增殖的影响

3．5 猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗中病毒毒力(TCID50)

3．6 AJS对PrV的抑制作用

3．7 AJS对PrV的直接杀灭作用

3．8 AJS对免疫小鼠脑组织中PrV基因组DNA和基因mRNA表达的影响

3．9 免疫小鼠病料感染Vero细胞中PrV基因组DNA和基因mRNA表达

3．10 AJS体外对PrV基因组DNA和基因mRNA表达的影响

4 讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢