基于甘露糖受体的新型非病毒基因传递载体的制备及评价

摘要

目的:根据甘露糖载体的特点设计合成精胺—甘露聚糖载体(SM)，对其及其基因复合物进行表征，并将SM基因传递体系应用到体内基因传递中，实现肝脏靶向转染;将其应用在体外基因传递，实现对甘露糖受体表达的细胞高效转染，并探索其作用机理。 方法:1.合成不同接枝率SM载体并以FTIR、DSC、H1-NMR及元素分析测试表征，MTT法筛选其细胞毒性，通过虫荧光素酶报告基因筛选其转染效率，孵育法制备其复合物并进行粒径、电位、形态表征;2.利用SM/FITC-DNA通过活体成像技术观察SM基因复合物的组织分布，筛选其靶向性，测定粒径及转染效率评价血清对其干扰，利用组织切片HE染色评价SM传递体系的肝脏毒性，并通过绿色荧光蛋白报告基因载体转染肝脏评价其转染效率;3.MTT法评价SM基因传递体系在不同细胞的细胞毒性，并转染评价其在不同细胞上的转染效率，与PEI、Lipo、SP在MMR-及MMR+细胞上进行转染及毒性比较，并通过不同的竞争抑制剂、入胞抑制剂及钙离子螯合剂探究SM入胞机理，通过标记SM与DNA探索其在细胞内转运情况，并通过溶酶体染色探索其溶酶体逃逸情况。制备原代的骨髓源树突状细胞并初步鉴定，流式细胞术测定其对SM/FITC-DNA的摄取，利用EGFP报告基因对BMDC进行转染评价。 结论:成功设计合成了精胺—甘露聚糖非病毒基因载体材料，并对其进行表征。通过改变CDI的反应比例，成功合成了不同接枝率的SM载体材料，并对其进行了细胞毒性及转染效率的筛选，为后续的应用提供了实验依据。通过对SM与DNA孵育形成复合物的表征，证明SM与DNA在一定N/P可以形成粒径～100nm，电位～45mV的稳定的复合物体系，并具有规整的形态。将SM基因传递体系应用于体内的基因传递中，针对肝脏靶向性研究，SM/DNA复合物可以在一定接枝比例下一定N/P比时靶向于肝脏，相较裸DNA可以延长DNA在肝脏积累。与文献报道的阳性对照组PEI基因复合物相比较，SM基因传递体系具有更强的抗血清干扰能力，且对肝脏产生较小的毒副作用。在体内的转染评价中，SM基因传递体系可以产生与PEI相似及更好的转染效率。将SM基因传递体系应用于体外基因传递中，成功在四种细胞中进行了细胞毒性及转染效率的筛选，而SM在MMR表达的细胞中转染尤为高效。通过对比SM与其他非病毒载体，SM在MMR+细胞中具有高效、低毒的转染优势。通过进一步对SM在MMR+细胞中作用机制的研究，证明SM是通过MMR受体介导，并通过网格蛋白及内陷小窝两条入胞途径进入细胞中，其MMR介导需要钙离子的存在。而对SM/DNA复合物的胞内转运及内涵体逃逸的研究表明，SM/DNA可以成功从细胞内涵体中逃逸，并将DNA释放进入细胞核，而SM本身并不进入细胞核中。还进一步将SM基因传递体系应用在了原代骨髓源树突状细胞中，证明BMDC对SM的摄取率要远高于其他非病毒载体，并成功实现对BMDC的转染。

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致谢

摘要

全文缩写表

前言

第一章 精胺—甘露聚糖非病毒载体材料的合成、表征、筛选及其基因复合物的表征

1．1 仪器与试剂

1．1．1 仪器

1．1．2 试剂

1．2 实验方法

1．2．1 合成及表征

1．2．2 复合物的制备及表征

1．2．3 在HepG2细胞上的细胞毒性评价

1．2．4 在HepG2细胞上的转染效率评价

1．3 实验结果与讨论

1．3．1 合成

1．3．2 FTIR分析

1．3．3 DSC分析

1．3．4 H1-NMR分析

1．3．5 元素分析

1．3．6 HepG2上细胞毒性筛选

1．3．7 HepG2上转染活性筛选

1．3．8 复合物稳定性

1．3．9 复合物粒径、电位

1．3．10 复合物形态

1．4 本章小结

第二章 精胺—甘露聚糖非病毒载体内肝脏靶向及转染评价

2．1 仪器与试剂

2．1．1 仪器

2．1．2 试剂

2．2 实验方法

2．2．1 体内分布

2．2．2 粒径测定

2．2．3 血清干扰下的体外转染评价

2．2．4 肝脏在体毒性评价

2．2．5 肝脏在体转染评价

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 基因复合物肝脏靶向筛选

2．3．2 基因复合物在小鼠体内的组织分布

2．3．3 抗血清干扰

2．3．4 载体毒性评价

2．3．5 肝脏载体转染

2．4 本章小结

第三章 精胺—甘露聚糖非病毒载体体外特异性转染评价及其作用机理研究

3．1 仪器与试剂

3．1．1 仪器

3．1．2 试剂

3．2 实验方法

3．2．1 细胞毒性评价

3．2．2 转染效率评价

3．2．3 甘露糖受体鉴定

3．2．4 摄取实验

3．2．5 荧光标记

3．2．6 胞内转运实验

3．2．7 溶酶体逃逸实验

3．2．8 骨髓源树突状细胞的制备

3．2．9 细胞周期测定

3．2．10 BMDC摄取实验

3．2．11 BMDC转染实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 细胞毒性评价

3．3．2 转染评价

3．3．3 甘露糖受体的鉴定

3．3．4 不同非病毒载体的转染比较

3．3．5 不同非病毒载体的细胞毒性比较

3．3．6 摄取特异性比较

3．3．7 入胞途径比较

3．3．8 钙离子依赖性

3．3．9 胞内转运

3．3．10 内涵体逃逸

3．3．11 BMDC的制备与培养

3．3．12 BMDC上的摄取比较

3．3．13 BMDC上的转染比较

3．4 本章小结

全文总结

参考文献

综述 基于多糖聚合物的非病毒基因载体的研究进展

作者简历