芸薹根肿菌致病性及其生理小种分化的研究

摘要

十字花科作物根肿病也称根癌，是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）侵染引起的世界性土传病害，在中国乃至全世界范围危害严重。目前生产上主要采用农业防治、化学防治和生物防治，但鉴于农业防治劳动强度大、周期长且容易造成土壤板结;化学药剂防治，容易造成农药残留;生物防治研究不太成熟且生防菌种类有限等种种因素导致整体防效并不理想。因此，在生产上培育具有根肿病抗性的十字花科品种是最根本最安全的途径。但当前我们对于根肿病抗性的遗传规律并不十分明确，培育出的抗病品种通常具有生理小种特异性，加之病原菌变异迅速，使得其抗性不能持久，所以，要想有效地防治根肿病，一方面必须加大抗性品种筛选力度，为抗病育种提供多来源的抗性资源，另一方面，还要进一步明确病原菌的致病机理，加强根肿菌的早期检测，从而开展根肿病的综合防治。本研究通过比较不同接种方法的发病情况，研究室内接种的适宜方法，利用正交试验探讨接种最优发病体系;以收集到的130多个芸薹属蔬菜品种为材料，通过插入法进行抗病性鉴定，筛选抗病品种;利用光学显微镜鉴定和PCR检测的方法检测根肿组织中存在的根肿菌，并利用ECD系统鉴定了七个不同地区的芸薹根肿菌生理小种;分析了不同生理小种ITS序列的差异。取得了以下研究结果:
　　(1)插入法接种易感植株的病情指数最高，接种浓度是影响发病的关键因素。本试验研究了三种接种方法对易感植株发病程度的影响，结果显示，发病程度为插入法＞蘸根法＞注射法，病情指数呈依次递减趋势。同时利用正交试验探索室内接种的最优条件，主要研究接种浓度、接种次数、接种量和接种时间四个因素。结果表明，接种浓度是影响发病的关键因素。接种浓度越高，病指越高。另外，以新鲜和冷冻感病肿根为材料研究其致病性差异，结果显示，相较于冷冻病根，新鲜感病肿根的致病性更强，前者的病指为72.04，后者的病指只有27.78。
　　(2)不同病原菌存在致病性差异。用采自浙江省江山市白菜、上海青浦区白菜、浙江省温州市榨菜和浙江温岭甘蓝四个种植区的带菌土样对收集到的130多个芸薹属蔬菜品种进行抗病性筛选，结果显示，温岭地区和上海地区的病原菌致病性强度显著高于江山地区和温州地区。对于白菜类寄主，除了温州地区的病原菌致病性较弱外，其他三个地区的病原菌致病性都较强;对于芥菜类寄主，四个地区病原菌的致病性都表现的较强;而对于甘蓝类寄主，四个地区病原菌的病情指数则呈现比较大的差异。方差分析的结果显示，病原菌之间以及不同品种之间的p值均为0，表明不同病原菌和不同品种之间存在极显著的差异。
　　(3)抗性鉴定筛选获得2个广谱高抗品种。利用插入法接种四个不同地区的带菌土样，分析36个白菜类品种、78个甘蓝类品种、15个芥菜类品种和1个花叶芝麻菜的抗病性差异。抗病性鉴定结果表明，不同寄主品种对同一菌源或不同菌源的抗性反应有明显不同，而同一寄主品种对不同菌源的抗性反应也多表现不一致的现象，甚至截然相反的现象。本研究共筛选到具有广谱性的高抗品种2个:‘雪剑四号’和‘271’，广谱性的中抗品种5个，分别是‘777-1’、‘553-4’、‘544-2’、‘Y38-4’和‘573-12’，筛选得到的7个抗性材料均属于甘蓝类。
　　(4)湖北省火烧坪根肿菌生理小种为ECD17/31/31，湖北省利川根肿菌生理小种为ECD16/4/0，浙江省温岭根肿菌生理小种为ECD17/15/15，上海青浦区根肿菌生理小种为ECD16/0/5，西藏林芝、湖北省双河镇和浙江省温州根肿菌的生理小种类型同为ECD16/0/0。通过光学显微镜观察和PCR检测等手段验证了根瘤组织中的确存在有根肿菌，同时，利用欧洲根肿病鉴别系统(ECD)对采自上述七个不同十字花科蔬菜种植区的芸薹根肿菌进行了生理小种的鉴定，结果显示，火烧坪地区的生理小种为ECD17/31/31，温岭地区的生理小种为ECD17/15/15，青浦区生理小种为ECD16/0/5，利川地区的生理小种为ECD16/4/0，西藏林芝、湖北省双河镇和浙江省温州根肿菌的生理小种类型同为ECD16/0/0。
　　(5)利用已开发的三对引物，对芸薹属根肿菌rDNA ITS序列进行扩增，并筛选出两对可用于区分不同根肿菌的常规PCR引物。利用已开发的三对针对根肿菌rDNA的引物进行PCR扩增，扩增结果与NCBI数据库中的芸薹根肿菌rDNA序列信息进行比对，结果显示，1RF和2RF（18SF-18SR)引物可用于芸薹根肿菌的早期快速检测。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

缩写词(Abbreviation)

前言

1 文献综述：十字花科植物根肿病的致病性和遗传多样性研究进展

1．1 十字花科植物根肿病及抗病育种研究进展

1．1．1 根肿病的发生与危害

1．1．2 根肿病的症状识别

1．1．3 芸薹根肿菌的生物学特性

1．1．4 根肿病的寄主及病原菌的侵染方式

1．1．5 芸薹根肿菌的检测

1．1．6 根肿菌的接种方法

1．1．7 根肿病抗病育种研究

1．2 十字花科植物根肿芸薹菌的致病性与遗传多样性研究

1．2．1 芸薹根肿菌与寄主互作

1．2．2 芸薹根肿病菌致病性分化

1．2．3 根肿病发病机理研究

1．3 十字花科植物根肿病综合防治措施

1．3．1 农业防治

1．3．2 药剂防治

1．3．3 生物防治

1．4 前景与展望

2 优化接种方法的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 植物材料

2．1．2 病原菌来源

2．1．3 接种液的制备

2．1．4 接种试验优化的研究

2．2 结果与分析

2．2．1 不同接种方法对发病程度的影响

2．2．2 不同保存形式的菌源对发病程度的影响

2．2．3 室内接种条件的优化处理

2．3 讨论

3 芸薹属作物根肿病抗性品种的筛选

3．1 材料与方法

3．1．1 试验材料

3．1．2 病原菌来源

3．1．3 材料抗／感根肿病鉴定

3．1．4 数据统计分析

3．2 结果与分析

3．2．1 根肿病抗／感鉴定试验

3．2．2 不同材料对根肿病抗性差异及显著性分析

3．2．3 欧氏距离连锁聚类分析

3．3 讨论

4 芸薹根肿菌生理小种的检测

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌种来源

4．1．3 ECD鉴别寄主抗／感根肿病鉴定

4．1．4 数据统计分析

4．2 结果与分析

4．2．1 上海青浦区大盈镇根肿菌生理小种鉴定

4．2．2 湖北长阳火烧坪根肿菌生理小种鉴定

4．2．3 浙江省台州市温岭根肿菌生理小种的鉴定

4．2．4 湖北恩施利川根肿菌生理小种的鉴定

4．2．5 湖北恩施双河镇根肿菌生理小种的鉴定

4．2．6 浙江省温州市藤桥镇根肿菌生理小种的鉴定

4．2．7 西藏林芝地区根肿菌生理小种的鉴定

4．2．8 根肿菌的致病性分化

4．3 讨论

4．3．1 ECD16／0／0与为害台湾地区的芸薹根肿菌为同一生理小种

4．3．2 芸薹种根肿菌存在明显的致病性分化

4．3．3 芸薹种的芜菁亚种类作物可作为抗根肿病病育种的抗源材料

4．3．4 各地应因地制宜，选择栽培不同的蔬菜以减轻根肿病的为害

5 芸薹根肿菌的快速鉴别

5．1 材料与方法

5．1．1 芸薹根肿菌生理小种来源

5．1．2 PCR引物及其来源

5．1．3 病根组织总DNA提取

5．1．4 PCR反应体系及扩增程序

5．2 结果与分析

5．2．1 根肿菌的镜检观察

5．2．2 测序结果分析

5．2．3 各生理小种的序列分析

5．2．4 各生理小种的系统进化树分析

5．3 讨论

5．3．1 P．brassicae不同生理小种的rDNA序列具有多态性

5．3．2 P．brassicae rDNA的28S区域保守程度较高

5．3．3 1RF和2RF两对引物可用于芸薹根肿菌的早期检测

结论

参考文献

附件

作者简历