不同处理方式对酸性硫酸盐土中微生物群落结构的生态学研究

摘要

硫是水稻必需的营养元素之一，而硫酸盐还原菌(sulfate-reducingbacteria，SRB)是稻田土壤中硫酸盐还原过程中重要的功能菌群。水稻田是典型的生态环境，经常被用来研究土壤功能微生物的群落结构。研究水稻田微生物群落结构的组成以及可能发生的变化，对于明确水稻土生物地球化学循环过程与线路，比较稻田土壤系统可持续发展等问题均具有重要意义。
　　本论文以广州冲蒌酸性硫酸盐水稻土为对象，通过土壤DNA的提取、多聚酶链式反应(PCR)、变性梯度电泳(DGGE)和测序等一系列分子生物学手段，深入研究水稻土改良后土壤中细菌、古菌和SRB种群群落结构的变化情况，探讨了水稻土中硫素生物地球化学循环过程。论文的主要内容与研究成果如下:
　　1、水稻田土壤主要化学指标-pH、土壤有机碳、有效磷和硫酸盐含量随着土壤改良而增加。水稻土主要微生物生化指标微生物量碳，与对照相比也有显著的增加。添加5％的生物炭的处理土样的微生物量碳增多的程度高于5％的有机肥和1％的石灰处理。
　　2、本研究设计6个处理，分别为:(1)对照(CK)，荒土;(2)冲蒌水稻土（改良前）;(3)冲蒌水稻土（改良）;(4)添加1％石灰;(5)添加5％有机肥;(6)添加5％生物炭。用以研究水稻土中细菌的群落结构对不同施肥处理的响应。水稻田细菌的群落多样性在添加改良剂下明显增加，细菌的群落结构发生相应的改变。对细菌的16SrDNA基因进行分析得出，不同改良处理下水稻土细菌群落结构有一定的变化，但是优势类群没有明显变化。测序分析得到优势菌种的分类集中为放线菌门（Actinobacteria），也含有少量的存在于厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）。而且它们与放线菌属(Actinomyces)、未培养细菌（Unculturedbacterium）、硫单胞菌属（Thiomonas）、变形菌（Deltaproteobacteria）的同源性较好。
　　3、通过模拟培养试验，研究了酸性硫酸盐水稻土中添加石灰、生物炭和有机肥后，硫酸盐还原过程及SRB的群落动态变化。基于DGGE的聚类分析(ClusterAnalysis)表明，在水稻的不同改良处理，荒土与自然改良的非根际水稻土中SRB的群落结构均发生了明显的改变，但是，短期模拟改良的土壤与荒土中的SRB的群落结构无显著差异。系统发育分析表明SRB分属于分属于Desulfonema，Desulfomicrobium,Desulfovibrio,Thiococcus,Thiobacillus和UnculturedSRB共5个SRB类群，其中未能培养的SRB为优势类群。
　　4、不同改良的酸性硫酸盐水稻土壤环境中，古菌群落结构的多样性非常丰富，但由于其多样性受土壤酸碱度、水分、养分等多种因子的影响，在不同改良的土壤环境中其多样性存在差异。古菌在酸性土壤环境中种类最丰富，多样性指数最高。本实验向荒土中添加生物炭(5％)、有机肥(5％)和石灰(1％)土壤改良剂进行实验，然后研究不同改良剂对水稻土壤中古菌生态的影响。结果表明:与未作处理的荒土相比，添加改良剂的土壤中的古菌多样性减少。对部分优势菌种进行切胶测序发现，优势菌种与热变形菌纲(Thermoprotei)、未培养细菌（Unculturedbacterium）、甲烷杆菌纲（Methanobacteria）的同源性较好。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 水稻土的生物学特征

1．1．1 水稻土概况

1．1．2 土壤硫循环的生态意义及过程

1．2 硫酸盐还原菌的研究进展

1．2．1 硫酸盐还原菌的分类

1．2．2 硫酸盐还原的微生物过程

1．2．3 硫酸盐还原菌的应用

1．3 硫氧化菌的研究进展

1．3．1 硫氧化菌的分类

1．3．2 硫氧化途径

1．3．3 硫氧化菌的应用

1．4 土壤微生物群落结构的分子生态学研究方法

1．4．1 变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术

1．4．2 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术

1．4．3 末端限制性片段长度多样性(T-RFLP)技术

1．5 研究意义和目的

第二章 不同改良剂对水稻土中细菌群落结构的影响

2．1 引言

2．2 材料和方法

2．2．1 供试土壤

2．2．2 土壤样品的处理

2．2．3 土壤培养实验设计

2．2．4 土壤基本理化性质测定方法

2．2．5 土壤DNA的提取

2．2．6 聚合酶链式反应(PCR)

2．2．7 PCR产物的纯化

2．2．8 变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)

2．2．9 数据处理

2．3 结果与分析

2．3．1 土壤基本理化性质

2．3．2 土壤微生物量碳

2．3．3 土壤DNA的提取和扩增

2．3．4 细菌菌落结构的DGGE电泳

2．3．5 细菌群落结构多样性指数

2．3．6 土壤细菌16S rDNA条带测序及系统发育分析

2．4 讨论与小结

第三章 不同改良方式对水稻土中古菌群落结构的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 供试土壤

3．2．2 研究方法

3．2．3 土壤微生物生物量(碳、氮)的测定

3．2．4 土壤DNA的提取

3．2．5 聚合酶链式反应(PCR)

3．2．6 PCR产物的纯化

3．2．7 变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)

3．2．8 数据处理

3．3 结果与分析

3．3．1 古菌菌落结构的DGGE电泳

3．3．2 古茵群落基因多样性指数

3．3．3 水稻土古菌系统发育分析

3．4 小结

第四章 不同处理下水稻土中硫酸盐还原菌的多样性分析

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 供试土壤

4．2．2 研究方法

4．2．3 土壤DNA的提取

4．2．4 样品的PCR扩增

4．2．5变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)

4．2．6 数据处理

4．3 结果与分析

4．3．1 SRB茵落结构的DGGE电泳

4．3．2 SRB群落基因多样性指数

4．3．3 水稻土SRB系统发育分析

4．4 小结

第五章 结论

参考文献