重组里氏木霉产高活力外切-β-葡聚糖酶的研究

摘要

外切-β-葡聚糖酶(C1)是纤维素酶的重要组分之一，提高该组分的活力是增强纤维素酶协同降解性能、降低纤维素水解成本的关键技术之一。本文采用微晶纤维素琼脂平板法和滤纸崩解法分别对200个里氏木霉重组转化子进行筛选，得到了六个优良转化子，其滤纸崩解速率和在微晶纤维素琼脂平板上的生长速率都较大。进一步在摇瓶条件下进行复筛试验，获得了外切-β-葡聚糖酶高产转化子T.reeseiZU-101，液体培养48h，其C1酶活力可达18.24U·mL-1，是出发菌株的2.16倍;其纤维素酶的总活力(滤纸酶活力FPA)也提高了61.9％。
　　对T.reeseiZU-101的产酶性能进行了深入研究，与出发菌株相比，重组转化子的纤维素酶体系中，内切-β-葡聚糖酶(CMC)和纤维二糖酶的活力变化不大，但外切-β-葡聚糖酶活力明显提高。摇瓶培养120h，C1酶活力可高达34.66U·mL-1，是出发菌株的1.26倍。由于外切-β-葡聚糖酶得到了定向增强，滤纸酶活力也得到了明显提高，发酵120h达7.35IU·mL-1，比出发菌株提高了40％。
　　对重组转化子T.reeseiZU-101的分批补料发酵工艺进行了研究，结果表明:发酵48h后开始补加料液，其乳糖浓度为15％，C/N为7，每隔48h补加2％(V/V)，发酵168hC1酶活力可达55.689U·mL-1，是分批发酵工艺(batchprocess)的2.11倍。
　　以NaOH(2％)预处理后的玉米秸秆为底物，对T.reeseiZU-101所产纤维素酶的降解性能进行了深入研究，在底物浓度为10％、每克底物的纤维素酶用量为20FPIU（滤纸酶活力国际单位）的条件下，T.reeseiZU-101纤维素酶的酶解得率比出发菌株提高了43％;在T.reeseiZU-101纤维素酶系中，C1酶活力与CMC活力和滤纸酶活力的比例分别为1∶23和4∶1，而出发菌株纤维素酶系中，C1酶活力与CMC活力和滤纸酶活力的比例分别为1∶24和3∶1，纤维素酶复合体系中C1酶活力比例的提高，有利于结晶性较高的秸秆纤维素的协同降解。进一步研究发现:1）增大反应体系中纤维二糖酶活力的比例，可以显著提高酶解得率。在上述相同酶解条件下，当纤维二糖酶用量为300IU·g-1底物，纤维二糖酶活力(IU)与滤纸酶活力(IU)的比例为15∶1时，酶解得率可高达95％;2）添加木聚糖酶可以促进秸秆原料的酶解效率，在底物浓度为10％、每克底物的纤维素酶(FPA)、纤维二糖酶用量分别为20IU和100IU，添加木聚糖酶(300IU·g-1底物）可以使玉米秸秆的酶解得率达到94.4％。
　　本文的研究成果在可再生纤维素资源的生物转化与利用方面具有广阔的应用前景。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 木质纤维原料概述

1．3 纤维素降解微生物

1．3．1 纤维素降解真菌

1．3．2 纤维素降解细菌

1．3．3 纤维素降解放线菌

1．4 纤维素酶概述

1．4．1 纤维素酶的组成

1．4．2 纤维素酶的结构

1．4．3 纤维素酶的作用机制

1．4．4 纤维素酶的应用

1．5 外切β-葡聚糖酶的发展现状

1．5．1 纤维素酶面临的问题及其发展现状

1．5．2 内切-β-葡聚糖酶基因和纤维二糖酶基因的克隆与表达

1．5．3 外切-β-葡聚糖酶基因的克隆与表达

1．6 本课题的目的和意义

1．7 本课题的研究内容及技术路线

第二章 外切-β-葡聚糖酶基因重组里氏木霉的筛选

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 菌株

2．2．2 培养基

2．2．3 主要实验仪器

2．2．4 筛选方法

2．2．5 摇瓶产酶试验

2．2．6 纤维素酶活力的测定

2．3 结果与讨论

2．3．1 微晶纤维素琼脂平板法筛选

2．3．2 滤纸崩解法筛选

2．3．3 重组转化子摇床产酶试验结果

2．4 小结

第三章 重组转化子T．reesei ZU-101发酵产纤维素酶试验

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 菌株

3．2．2 培养基

3．2．3 纤维素酶活力的测定

3．3 结果与讨论

3．3．1 重组转化子T．reesei ZU-101产外切-β-葡聚糖酶的产酶进程

3．3．2 重组转化子T．reesei ZU-101产滤纸酶的产酶进程

3．3．3 重组转化子T．reesei ZU-101产内切-β-葡聚糖酶的产酶进程

3．3．4 重组转化子T．reesei ZU-101产纤维二糖酶的产酶进程

3．4 小结

第四章 重组转化子T．reesei ZU-101补料发酵工艺研究

4．1 前言

4．2 材料与方法

4．2．1 菌株

4．2．2 培养基

4．2．3 纤维素酶活力的测定

4．2．4 发酵方法

4．2．5 补料方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 补料时间的确定

4．3．2 补料浓度的确定

4．3．3 补料C／N的确定

4．4 小结

第五章 重组转化子T．reesei ZU-101对玉米秸秆酶解性能的研究

5．1 前言

5．2 材料与方法

5．2．1 酶解底物原料

5．2．2 酶制剂

5．2．3 柠檬酸缓冲溶液(1M，pH 4．45)

5．2．4 DNS试剂

5．2．5 预处理工艺

5．2．6 酶解方法

5．2．7 还原糖测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 重组里氏木霉转化子T．reesei ZU-101和出发菌株的酶解试验

5．3．2 纤维二糖酶对酶解的影响

5．3．3 最佳纤维素酶酶系组成比例的确定

5．3．4 预处理对玉米秸秆酶解的影响

5．4 小结

第六章 结论与建议

6．1 结论

6．2 建议

参考文献

附录