FK506生物合成中酰基转移酶和途径特异性调控因子的研究

摘要

FK506（他克莫司）是一种23元环的大环内酯类抗生素，由聚酮合酶-非核糖体肽合成酶（PKS-NRPS）合成，被广泛用作免疫抑制剂、抗癌药、杀菌剂等，市场价值极高。本文以FK506工业生产菌株筑波链霉菌（Streptomycestsukubaensis）YN06为对象研究FK506的生物合成机制与调控机制。我们通过生物信息学分析和体外生化反应表征了FK506关键合成酶----酰基转移酶AT10FkbA，结果表明AT10FkbA的功能是将丙二酸单酰基(M)从丙二酸单酰基辅酶A(M-CoA)转移到自身上形成M-O-AT10FkbA中间体，然后将M转移到底物ACP10FkbA上形成M-S-ACP10FkbA，在第一个步骤自酰化反应中AT10FkbA对M和甲基丙二酸单酰基(MM)都有底物选择性，在第二个步骤转酰基反应中AT10FkbA只对M有底物选择性。分子遗传学表征途径特异性调控因子Tcs2的结果表明，Tcs2在FK506合成中可能起正调控作用，但是EMSA表征并没有在FK506合成基因簇中找到Tcs2的靶点，最后通过高表达tcs2构建了一株FK506高产菌株，FK506产量提高了约20％。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 链霉菌次级代谢合成机制的研究进展

1．1．1 非核糖体肽合成酶(NRPS)

1．1．2 聚酮合酶

1．1．3 酰基转移酶

1．2 链霉菌次级代谢调控

1．2．1 全局性调控

1．2．2 多效性调控

1．2．3 途径特异性调控

1．3 FK506合成与调控机制的研究进展

1．3．1 FK506的作用机制

1．3．2 FK506的合成途径

1．3．3 FK506的合成调控机制

1．4 本课题的研究内容

第二章 酰基转移酶的底物选择性

2．1 材料

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器和设备

2．1．3 培养基

2．1．4 主要试剂和溶液

2．1．5 酶和生化试剂

2．2 方法

2．2．1 PCR扩增基因

2．2．2 核酸片段割胶回收

2．2．3 加A尾及与pTA2载体的连接反应

2．2．4 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．2．5 大肠杆菌感受态细胞的转化

2．2．6 大肠杆菌质粒抽提

2．2．7 质粒酶切

2．2．8 大肠杆菌中重组蛋白表达

2．2．9 蛋白纯化

2．2．10 酰基-O-AT的获得

2．2．11 全辅基化ACP(holo-ACP)的生化合成

2．2．12 酰基-S-ACP的获得

2．2．13 蛋白的LC-MS分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 在大肠杆菌中表达AT10FkbA、ACP10FkbA、ACP2FkbB和蛋白纯化

2．3．2 AT10FkbA的自酰基化

2．2．3 AT10FkbA催化的转酰基化

2．2．4 AT10FkbA催化的转酰基化反应中对ACP底物的选择性

2．4 小结

第三章 FK506合成的途径特异性调控

3．1 试验材料

3．1．1 大肠杆菌菌株和质粒

3．1．2 实验仪器和设备

3．1．3 培养基(固体的需加1．5-2．5％不等的琼脂粉)

3．1．4 主要试剂和溶液

3．2 方法

3．2．1 大肠杆菌Fosmid抽提

3．2．2 链霉菌基因组提取

3．2．3 E．coli-链霉菌接合转导

3．2．4 凝胶阻滞电泳

3．2．5 FKS06检测方法

3．2．6 PCR-targeting法敲除

3．3 结果与讨论

3．3．1 筑波链霉菌培养、发酵及检测条件的摸索

3．3．2 途径特异性调控

3．3．3 体外实验

3．4 小结

第四章 总结与展望

参考文献

攻读硕士学位期间主要学术成果

致谢