Sirt1对脓毒症致急性肾损伤保护作用及机制的实验研究

摘要

脓毒症是创伤、休克、感染、大手术等临床危重症患者的严重并发症之一，是导致脓毒性休克(septic shock)和多器官功能障碍综合症(Multiple OrganDysfunction Syndrome MODS)的重要因素，病死率居高不下，而脓毒症合并急性肾损伤（Acute Renal Injury AKI）更是危重患者不良预后的独立危险因素。流行病学资料显示，在重症监护病房(Intensive Care Unit ICU)患者中，严重脓毒血症和脓毒症休克是AKI发生的最主要原因，约30％-50％的脓毒血症患者发生AKI，脓毒症致AKI约占所有病因引起AKI发生的50％左右。近年来，随着AKI早期诊断和肾脏替代治疗水平的不断提高，AKI患者预后较以前有所改善，但值得关注的是，与非脓毒症致AKI及单纯脓毒血症患者相比，脓毒症致AKI患者死亡率显著增加，维持在50％-70％左右。
　　脓毒症致AKI之所以有如此高的死亡率，与其机制目前尚不明确息息相关。早期研究认为休克状态下肾的缺血/低灌注，即肾血流动力学改变所导致的肾小管上皮细胞坏死是脓毒症AKI的主要病理生理机制，但越来越多的证据表明，肾血流量减少并非严重感染时肾损伤的核心机制，脓毒症致AKI发生受多因素影响，除了血流动力学改变外，肾脏细胞凋亡、内毒素诱发的复杂的炎症和免疫网络反应、内皮功能紊乱、肾小球内栓塞以及坏死细胞致肾小管阻塞等也参与其病理生理过程的改变，其中，肾小管上皮细胞凋亡可能在脓毒症致AKI中起着关键性作用。在凋亡过程中有几个蛋白水解酶家族被激活，Caspases是其中被研究最为深入的蛋白酶。Caspase-3是外源性的死亡受体途径和内源性的线粒体途径共同激活的下游效应子。有研究表明应用Caspases抑制剂降低了肾毒性物质甘油-AKI、缺血再灌注-AKI、内毒素(LPS)-AKI肾组织细胞凋亡，保护了肾功能。
　　沉默信息调节因子2相关酶类（Sir2-related enzymes，Sirtuins），是一种高度保守的NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶类，在基因沉默、基因组稳定性、细胞寿命以及代谢调节上具有必不可少的作用。既往对Sirt1研究主要聚焦其在与衰老相关疾病如肥胖、糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤中的作用，近年来，Sia1激活对肾脏损伤保护性作用已成为肾脏病研究领域新的研究热点。实验研究表明，Sirt1可通过其抗氧化应激、线粒体再生及抑制细胞凋亡等作用，参与氧化剂、顺铂以及缺血再灌注诱导肾脏损伤的保护。然而，迄今为止，关于Sirt1在脓毒血症致AKI中作用国内外未见报道。
　　本课题聚焦Sirt1在脓毒症致肾脏损伤中的作用及其机制，通过盲肠结扎穿孔术(cecalligationandpuneture，CLP)，制备脓毒症AKI小鼠模型，运用RT-PCR、Western-blot、免疫组化等细胞分子生物学技术手段，观察Sirt1拮抗剂(EX527)干预后，脓毒症AKI小鼠肾组织病理学、肾功能、肾损伤标志物的变化、Sirt1基因mRNA和蛋白表达及肾组织细胞凋亡，肾组织Casepase-3表达的变化情况，来明确Sirt1是否对脓毒症致AKI起保护作用，探讨Sirt1是否可能通过下调Caspase-3的表达来减少肾组织的凋亡，从而达到保护肾功能的目的，为脓毒症致AKI分子机制的阐明及防治靶点的确定提供新的理论和实验基础。
　　第一部分脓毒症AKI小鼠模型制备
　　目的:探讨一种简单易行、接近临床的脓毒症致AKI小鼠模型的制备方法。方法:健康清洁级雄性C57BL/6小鼠62只，随机分为3组:①正常对照组(Normal组):6只，不经任何处理;②假手术组(Sham组):28只，除不行盲肠结扎穿孔外，余同CLP组;③模型组(CLP组):28只，按照Miyaji T的方法进行盲肠结扎穿孔术。假手术组和CLP组均在制模后设置6h、12h、24h三个时间点，每组每个时间点6只小鼠，摘眼球取血检测血清肌配(Cr)、尿素氮(BUN)水平，代谢笼收集尿液，检测尿NGAL和KIM-1水平，光镜下观察肾组织病理学改变，每组余10只小鼠观察生物学行为变化及4天、7天存活率。计量资料以均数±标准差（(x)±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，应用Kaplan-Meier法计算累计生存率并绘制生存曲线，生存曲线的比较采用log-rank检验， P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1.各组肾功能变化比较
　　Sham组在各时间点血清肌酐值与对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。CLP组在CLP后6h肌酐有增高，但与Sham组相比无显著性差异(P＞0.05)，在术后12h、24h明显升高，与Sham组相比有显著性差异(P＜0.01)。
　　Sham组在各时间点血清尿素氮值与对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。CLP组在CLP后6h尿素氮即增高，在术后12h、24h维持高水平，与Sham组相比有显著性差异(P＜0.01)。
　　2.各组小鼠尿肾损伤标志物变化比较
　　Sham组尿NAGL水平、尿KIM-1水平在术后6小时有增高，但与对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。CLP组尿NAGL水平、尿KIM-1水平在术后各时间点均显著升高，与Sham组相比有显著性差异(P＜0.01)。
　　3.各组小鼠肾脏病理改变及肾损伤病理评分结果
　　Sham组和正常对照组小鼠的肾脏组织结构清晰，肾小管、肾小球正常，肾小管上皮细胞未见变性、萎缩、肿胀坏死或炎性浸润，管腔无扩张。
　　CLP组肾小球毛细血管扩张、充血，肾小管上皮细胞水肿、颗粒样变性或空泡变性。
　　Sham组各时间点肾脏组织损伤病理评分与正常对照组相比，无显著性差异;CLP组肾脏组织损伤病理评分在术后各时间点均显著升高，与Sham组相比有显著性差异(P＜0.01)。
　　4.各组小鼠生物学行为与生存率的比较
　　Sham组小鼠麻醉苏醒快，苏醒后活动自如，进食好，CLP组小鼠麻醉苏醒慢，精神萎靡，气促。Sham组4天、7天小鼠全部存活，CLP组4天、7天生存率分别为60％、30％，两组比较有显著性差异(P＜0.01)。
　　小结
　　1.CLP小鼠出现脓毒症表现，同时肾损伤标志物和血清肌酐、尿素氮显著增高，肾组织损伤病理评分显著增高，表明脓毒症致AKI模型制模成功。
　　2.通过控制实验动物的品种、年龄及CLP模型制作的标准化，可得到制备简单、贴近临床的脓毒症致AKI模型。
　　第二部分 Sirt1对脓毒症致AKI的作用
　　目的:探讨Sin1在脓毒症致AKI中的作用。
　　方法:健康清洁级雄性C57BL/6小鼠48只，随机分为2组:①假手术组(Sham组):24只，除不行盲肠结扎穿孔外，余同脓毒症AKI组;②脓毒症AKI组(septic AKI组):24只，行盲肠结扎穿孔术。两组均在制模后设置1天、3天、7天、14天四个时间点，每个时间点6只小鼠，留取标本，分别采用RT-PCR和Western Blot检测肾皮质Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表达，余同第一部分，两组间比较采用t检验。
　　结果:
　　1.两组小鼠肾功能变化比较
　　Septic AKI组在CLP术后1天、3天血清肌酐、尿素氮值明显升高，与Sham组相比有显著性差异P＜0.01）;在术后7天、14天已下降到Sham组水平(P＞0.05)。
　　2.两组小鼠尿肾损伤标志物变化比较
　　Septic AKI组在术后1、3、7天尿NGAL和KIM-1水平均显著升高，与Sham组相比有显著性差异(P＜0.01)，14天尿NGAL和KIM-1水平均下降到Sham组水平(P＞0.05)。
　　3.两组小鼠肾脏组织损伤病理评分结果
　　Septic AKI组在术后1、3、7天均显著升高，与Sham组相比有显著性差异(P＜0.01)，14天下降，与Sham组相比无显著性差异(P＞0.05)。
　　4.两组小鼠肾皮质Sirt1基因表达变化
　　Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表达在第1天即升高，第3-7天达高峰，与 Sham组相比有显著性差异，(P＜0.01);第14天Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表达下降到Sham组水平(P＞0.05)。
　　小结:
　　1.脓毒症致AKI组小鼠在CLP术后早期就表现为肾脏Sirt1基因mRNA和蛋白表达都明显升高，表明Sirt1基因在脓毒症AKI早期就被激活
　　2.脓毒症致AKI组小鼠肾脏Sirt1基因动态变化，提示内源性Sirt1基因激活参与了脓毒症致AKI的病理生理过程，结合文献，我们推测内源性Sirt1基因激活可能对脓毒症致AKI起保护作用，这还有待于下一步采用Sirt1抑制剂干预是否加重肾损伤来进一步证实。
　　第三部分 Sirt1在脓毒症致AKI中的保护作用机制探讨
　　目的:探讨Sirt1对脓毒症致AKI保护作用可能的机制，Sirt1是否通过Caspase-3的抑制，参与抑制肾小管上皮细胞凋亡作用，而起肾保护作用。
　　方法:健康清洁级雄性C57BL/6小鼠70只，随机分为3组:①假手术组(Sham组):10只，除不行盲肠结扎穿孔外，余同脓毒症AKI组;②脓毒症AKI组(septic AKI组):30只，行盲肠结扎穿孔术，术后尾静脉注射等量生理盐水，每天1次，连续7天;③EX527干预组（EX527组）:30只，行盲肠结扎穿孔术后，尾静脉注射Sirt1拮抗剂（EX527，10mg/kg），每天1次，连续7天。观察每组小鼠生物学行为变化及7天病死率，并予7天后每组随机取6只存活小鼠，留取标本，采用TUNEL法检测肾组织细胞凋亡，采用免疫组化法检测肾组织Caspase-3的表达，余同第二部分。统计方法:对部分数据进行相关性分析，余同第一部分。
　　结果:
　　1.各组小鼠肾功能变化比较
　　脓毒症AKI组血清肌酐、尿素氮水平已经下降到Sham组水平，与脓毒症AKI组相比，EX527干预组血清肌酐水平略升高，但无显著性差异(P＞0.05)，血清尿素氮水平升高，有显著性差异(P＜0.05)。
　　2.各组小鼠尿肾损伤标志物变化比较
　　脓毒症AKI组尿NGAL、尿KIM-1显著升高，与Sham组相比有显著性差异(P＜0.01); EX527干预组与脓毒症AKI组相比，升高更明显，有显著性差异(P＜0.01)。
　　3.各组小鼠肾脏组织损伤病理评分结果
　　脓毒症AKI组与Sham组相比，有显著性差异(P＜0.01); EX527干预组与脓毒症AKI组相比，升高更明显，有显著性差异(P＜0.05)。
　　4.各组小鼠肾皮质Sirt1基因表达变化
　　脓毒症AKI组肾皮质Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表达均明显高于Sham组，有显著性差异(P＜0.01);EX527干预组肾皮质Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表达均明显下降，与脓毒症AKI组相比有显著性差异(P＜0.01)。
　　5.各组肾组织细胞凋亡率比较
　　TUNEL检测结果表明Sham组凋亡细胞少，脓毒症致AKI组细胞凋亡率明显高于Sham组，分别为9.15±2.27和1.87±0.29，有显著性差异(P＜0.01)，EX527干预组（12.55±3.89）较脓毒症致AKI组细胞凋亡数更增多(P＜0.05)。
　　6.各组肾组织caspase-3免疫组化表达的比较
　　Sham组caspase-3表达很少，主要表达于肾小管上皮细胞胞质中;脓毒症致AKI组与Sham组相比较，caspase-3表达增多，在肾小管上皮细胞、肾小球血管内皮细胞胞质和胞核均有表达，EX527干预组caspase-3表达较脓毒症致AKI组更明显。图像分析显示:三组之间capase-3表达有统计学差异(P＜0.01)，其中脓毒症致AKI组（7.48±1.43）较Sham组（2.05±0.31）明显增高(P＜0.01)，EX527干预组（9.4±2.12）较脓毒症致AKI组有更高的表达率(P＜0.05)。
　　7.各组小鼠生存率的比较
　　Sham组7天小鼠全部存活，脓毒症AKI组、EX527干预组7天生存率分别为36.67％、23.33％，三组之间生存率相比有显著性差异，但脓毒症AKI组与EX527干预组相比无显著性差异(P＞0.05)。
　　8.相关性分析
　　肾组织细胞凋亡率、肾组织caspase-3表达与尿NGAL、尿KIM-1及肾脏病理评分成明显正相关，相关系数分别为0.852、0.873、0.749及0.835、0.880、0.704，P均＜0.01。肾组织Stir1mRNA、 Sirt1蛋白表达与上述指标没有明显相关性(P＞0.05)。在EX527干预组，肾组织Stir1mRNA及蛋白表达与肾组织细胞凋亡率表达成明显负相关，相关系数分别为-0.898和-0.836，P均＜0.05，与肾损伤标志物尿NGAL、KIM-1及肾组织caspase-3表达亦成负相关，但未达到统计学差异(P＞0.05)。
　　小结:
　　1.脓毒症致AKI组小鼠肾组织细胞的凋亡率和肾组织Caspase-3的表达增加，且与肾损伤标志物尿NGAL、KIM-1水平及肾脏损伤病理评分成正相关，表明肾组织凋亡是脓毒症致AKI的可能发病机制。
　　2.EX527干预组肾皮质Sirt1基因mRNA和蛋白表达都明显下降，但尿NGAL和KIM-1及肾小管损伤评分却进一步升高，证实抑制Sirt1基因表达加重脓毒症致AKI的肾脏损害。
　　3.相关分析显示EX527干预组小鼠肾皮质Sirt1基因表达与肾组织细胞凋亡率成明显负相关，与Caspase-3表达成负相关，但未达到统计学意义，推测Sirt1抑制剂可能通过增加肾组织的凋亡从而加重了脓毒症致AKI的肾脏损害，caspase-3可能是参与Sirt1抑制肾组织细胞凋亡的信号通路之一，但其并非唯一的途径，有可能其他凋亡通路也参与其中，有待进一步研究。
　　综合上述三部分内容，本研究得出如下结论:
　　1.CLP能够成功制备脓毒症致AKI模型，通过控制实验动物的品种、年龄及模型制作的标准化，可得到贴近临床的脓毒症AKI模型，简单、经济、可复制。
　　2.脓毒症AKI早期内源性Sirt1基因就被激活，对脓毒症致AKI起保护作用。
　　3.脓毒症时Sirt1基因激活，可能通过减少Caspase-3的表达来抑制肾细胞的凋亡而发挥肾保护作用，但Caspase-3并非唯一的途径，其他凋亡通路可能也参与其中，有待进一步研究证实。