不同细胞生长因子在皮瓣坏死创面愈合中作用和机制研究

摘要

背景：
　　皮瓣手术是整形重建和口腔颌面部手术中最重要的技术之一。然而，无论是在实验还是临床中，外科皮瓣坏死都是很难完全预防和避免的。皮瓣坏死往往导致皮瓣摘除。很多的研究都尝试通过药物，提高皮瓣成活率。然而，在这些研究中也有明显的一些不足。许多研究中没有动物模型解剖学证据;当坏死即将发生时，没有很好的解决方法;虽然一直对坏死的预防性研究很多，但关于促进坏死修复的研究很少，对皮瓣坏死创口治疗的研究更为鲜见。
　　KGF、EGF和VEGF是生长因子领域研究最多的几个生长因子，大量的文献都确定其分别特异性对上皮细胞、主要对上皮细胞、特异性对血管内皮细胞有很强的生长促进作用。KGF对上皮细胞的特异性作用，使其能促进上皮细胞增殖的同时，不促进纤维生长，不导致疤痕形成，成为促进上皮创口愈合最好的候选。EGF是临床上应用最多的生长因子之一，其对上皮的促进作用得到很多患者及医生的认同。VEGF是迄今为止发现的促进血管新生最有效的生长因子，能够极大地提高外科皮瓣的成活，预防皮瓣坏死。
　　皮瓣坏死的基因预防及治疗是一种极有潜力的方法，是未来研究的发展方向。当今皮瓣的基因研究主要是以生长因子作为治疗性基因完成的。如何以最佳的方法将外源性DNA导入皮瓣，使细胞接收并表达外源DNA，一直是值得大家研究和探讨的问题。
　　我们以腺病毒为载体(Ad)，携带角化细胞生长因子(KGF)基因的方法，利用复制缺陷型腺病毒载体重组KGF基因，通过其强感染能力与转基因能力，在体外体内特异性表达有活性的KGF蛋白，发挥定向修复组织损伤的作用。另外我们直接在大鼠背部的坏死皮瓣区域中和皮肤中注入EGF和VEGF，观察联合应用生长因子是否会对皮瓣区坏死愈合起作用。
　　方法：
　　1.PacⅠ核酸内切酶酶切鉴定腺病毒质粒，测序检测是否质粒存在变异。PacⅠ核酸内切酶酶切pAd-KGF，线性化后的pAd-KGF转染进HEK293(293)细胞后，制备Ad-KGF。应用293细胞扩增、纯化得到Ad-KGF病毒。应用于后续细胞及动物实验，并观察病毒转染293细胞后，细胞形态及病毒的感染能力。
　　2.Ad-KGF感染正常细胞系PA317，HUVEC，HaCaT，和293细胞后，观察病毒的感染的能力;提取受感染细胞的RNA，逆转录得到cDNA后，进行半定量PCR和荧光定量PCR，检测细胞内KGF的表达水平;通过ELISA，检测受感染细胞上清中KGF的表达水平;通过划痕实验模仿伤口，培养HaCaT细胞48小时，确定KGF对上皮细胞生长迁移的作用;将PA317细胞，HUVEC细胞和HaCaT细胞接种于Transwell小室，293细胞+Ad-KGF转染24小时(293+Ad-KGF)，293细胞+ Ad转染24小时(293+Ad)，HaCaT，293细胞和293细胞+KGF(293+KGF)接种于下室内，观察KGF和Ad-KGF对成纤维细胞系，血管内皮细胞系和上皮细胞系的生长迁移作用。
　　3.我们首先解剖大鼠背部，研究确定大鼠背部血管走行。在传统大鼠背部皮瓣模型上，改良手术及实验过程，使皮瓣发生坏死。记录大鼠的体重，皮瓣坏死面积和愈合情况。在术后第15天，25天，和45天过量水合氯醛处死大鼠，取背部坏死皮瓣标本，进行组织化学染色分析。
　　4.在建立大鼠背部皮瓣模型之后，所有动物分为四组。将1 ml PBS+dexamethasone(DXM),1 ml PBS+Ad-KGF+DXM, or1 ml PBS+Ad+DXM分别注入大鼠背部皮瓣坏死区皮下和创口边缘，分别于术后5天，10天，20天，和30天注射相同的药物。隔日记录体重，直至创面坏死愈合。术后第15天，25天，和35天过量水合氯醛处死大鼠，取背部坏死皮瓣标本，进行组织化学Masson染色、免疫组化染色分析和荧光定量PCR分析，上皮及上皮下组织的生长情况，上皮的生长厚度，取血清进行ELISA检测KGF表达水平。
　　5.首先通过细胞迁移实验确定EGF和VEGF对PA317，HUVEC，和HaCaT细胞迁移的活性。建立大鼠背部皮瓣模型，坏死发生后，沿创口边缘及坏死皮下注入1 ml PBS+EGF(150 mg/kg),1 ml PBS+VEGF(10μg), or1 ml PBS+EGF(150μg/kg)+VEGF(10μg)。隔日记录体重并注射相同的药物，直至创面坏死愈合。术后第15天和25天过量水合氯醛处死大鼠，取背部坏死皮瓣标本，进行组织化学Masson染色和免疫组化染色分析创缘上皮及上皮下组织的生长情况，上皮的生长厚度，并取血清进行ELISA检测。
　　结果：
　　1.酶切鉴定结果与设计和文献相符，证明载体pAd-KGF构建正确。pAd-KGF质粒测序结果显示起始位点:第185bp，ATG。终结位点:第679bp，TAA。全序列对比小鼠KGF基因序列，二者完全匹配，不存在突变。病毒转染正常293细胞24小时，开始出现细胞变圆;荧光显微镜镜下观察，部分293细胞开始表达大量荧光蛋白。转染第96小时后，所有293产生细胞病理效应，显微镜下观察所有细胞呈圆球形葡萄样改变，漂浮于培养液中，荧光显微镜镜下观察293细胞呈圆球形，表达大量荧光蛋白。重组腺病毒Ad-KGF和Ad在293细胞内大量扩增，并收集后。测得Ad-KGF病毒的效价滴度为2×1011PFU/ml， Ad病毒的效价滴度为3×1012PFU/ml。
　　2.pAd-KGF为构建腺病毒质粒。半定量PCR证明pAd-KG内存在KGF表达基因。经过基因重组后的腺病毒Ad-KGF具有感染正常细胞，于正常细胞内表达KGF的能力。正常的293细胞不能表达KGF的mRNA，PA317细胞能分泌KGF，表达KGF mRNA。Ad-KGF感染293细胞后，细胞成功表达KGF mRNA，而在293细胞和293+空病毒Ad内不能表达KGF mRNA。通过ELISA检测培养液上清中外分泌的KGF含量。检测证明Ad空病毒转染细胞后48小时，上清液中不分泌KGF蛋白，而Ad-KGF转染细胞的后的48小时，细胞培养上清中能够检测到大量的KGF表达，且浓度随着Ad-KGF的滴度增加而增加。通过划痕实验，证明在KGF作用下，HaCaT上皮细胞的迁移能力显著增加。而对照组细胞开始出现凋亡现象。Transwell细胞迁移实验证明KGF能有效促进HaCaT上皮细胞生长迁移，而对HUVEC血管内皮细胞作用不明显，对PA317成纤维细胞没有明显作用。
　　3.大鼠背部七条静脉和一侧有超过二十条动脉分布。手术后三天，大鼠的体重会稍有下降，然后稳定上升。PBS组和空白组中坏死面积在9天内达到最高峰。从9至47天中，坏死面积逐渐减少，在47天坏死几乎完全愈合。组织病理检查中，可见术后15天，坏死创口边缘上皮细胞增生明显，有少量纤维成分生成，创口愈合区有大量小脉管形成和大量不成熟的纤维成分形成。至第35天，上皮增生修复较前明显弱，但较正常上皮，厚度仍明显增大。
　　4.成功建立大鼠背部皮瓣坏死模型后，四组动物术后体重均有轻度下降，从第三天开始，体重逐步上升，其中以DXM组的体重上升最明显。术后第五天，坏死成活区域分界清晰。术后第十天，坏死面积达到最大。随着不同药物的治疗，坏死面积在各组间都明显下降，且Ad-KGF组坏死面积缩小最为明显。Masson染色显示术后15天，四组坏死创口边缘上皮都明显增生，其中Ad-KGF组上皮细胞增生最多。术后35天，Ad-KGF组坏死伤口已经愈合，而其它三组还有较大的坏死面积。术后15天和25天，上皮细胞厚度在Ad-KGF组增生最为明显，术后35天上皮厚度与其它组间没有大的差异。
　　免疫组织化学分析显示，只有在Ad-KGF组的上皮和间充质细胞中有强阳性的KGF表达，而其它三组均为阴性。Anti-CD34免疫组织化学染色显示四组的小血管生成数目相当
　　5.PA317在EGF, VEGF，VEGF+EGF,或PA317作用下，没有显著性的生长差异。HUVEC对VEGF表现出明显生长加速，在EGF和VEGF联合作用下，生长更加明显，而与PA317共培养时，也有少量生长改变。HaCaT细胞在EGF和VEGF+EGF联合作用下都是表现出生长迁移能力提高。建立动物模型后，分组如下:PBS，EGF, VEGF, EGF+VEGF。四组动物术后体重均有轻度下降，从第三天开始，体重逐步上升，其中以EGF组的体重上升最少。随着不同药物的治疗，坏死面积在各组间都明显下降，且VEGF+EGF组坏死面积缩小最为明显。
　　术后15天和25天，Anti-CD34免疫组织化学染色显示EGF, VEGF和VEGF+EGF组的小微血管生成数目相当，都显著高于PBS组。
　　结论：
　　1.pAd-KGF经过酶切鉴定和测序鉴定具有KGF完全匹配的基因组。成功构建Ad-KGF和Ad，且具有感染细胞的能力。Ad-KGF和Ad经过扩增纯化的滴度为2×1011PFU/ml和3×1012PFU/ml，可以满足细胞及大鼠皮瓣实验的要求。
　　2.Ad-KGF和Ad可以高效转染PA317、HUVEC和HaCaT细胞，并在转染后高效表达活性KGF。KGF可有效促进HaCaT细胞生长，而对PA317、HUVEC细胞作用不明显。
　　3.本实验在确定大鼠背部血供系统基础上，设计形成一套简便且易于推广的手术和皮瓣坏死模型流程，成功建立了稳定的大鼠背部皮瓣坏死伤口模型，可以进行皮瓣坏死为目的基因或药物实验研究。
　　4.使用高表达KGF的腺病毒重组局部转染大鼠背部皮瓣坏死伤口，能有效促进坏死伤口的愈合。
　　5.EGF-VEGF联合应用能促进改良大鼠背部坏死创面愈合。