NK细胞调节移植抗宿主病中同种反应性T细胞应答的作用及机制研究

摘要

在本研究中我们首先分析临床造血干细胞移植后NK细胞及其受体的重建与aGVHD的关系;接着，我们通过动物模型和体外细胞研究探讨供者来源的NK细胞负向调节aGVHD中的同种反应性T细胞应答的作用及相关机制;最后我们探讨达沙替尼和AMD3100两个药物对NK细胞的体外扩增、移植物动员和生物学功能的调节作用。我们的研究有助于深入阐明NK细胞调节aGVHD中T细胞应答的机制，完善aGVHD的发生机制，建立aGVHD预警的生物学标志;同时对寻找aGVHD有效预防和治疗的新策略具有重大的理论和实际意义。
　　具体研究分为3部分:
　　1) Allo-HSCT后NK细胞及其受体的重建与aGVHD的关系;2）NK细胞抑制aGVHD中同种反应性T细胞应答的作用和机制;3）酪氨酸激酶抑制剂和干细胞动员剂对NK细胞的aGVHD调节作用的影响。
　　第一章 Allo-HSCT后NK细胞及其受体的重建与aGVHD的关系
　　目的:通过检测移植后Allo-HSCT后早期NK细胞及其受体的动态重建规律，分析与aGVHD的关系，为探讨NK细胞在Allo-HSCT中对aGVHD的调节作用提供线索，并为移植后进一步明确患者aGVHD危险分层和早期预警寻找合适的指标。
　　方法:研究对象为2012年4月至2013年12月在浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心接受异基因造血干细胞移植的患者，共63名患者及相应的健康供者进入临床研究，在造血干细胞移植后3月内每1-2周采血一次，使用流式细胞术检查移植物和移植后外周血中T和NK细胞的比例、NK细胞亚群分布、NK细胞表面NKG2D/DNAM-1/NKP46/NKG2A等受体表达以及T细胞表面CD25/CD69/MICA/MICB/PVR/Nectin2等表达，并结合临床GVHD资料进行统计分析。
　　结果:2012年5月-2013年12月，在浙江大学医学院附属第一医院骨髓移植中心，共有63例患者纳入研究，其中ALL27例，AML26例，NHL2例，MDS7例，CML1例。中位年龄30岁(12岁-50岁)，男性34例，女性29例。接受亲缘全相合移植22例，无关供者移植14例，半相合移植27例。共36例患者发生aGVHD(57.14％)，27例无aGVHD发生(42.86％)，分别纳入aGVHD组和无aGVHD组。在发生aGVHD组的患者，输注的移植物中NK细胞的百分比为（8.95±6.38）％、NK细胞绝对计数(19.87±14.72)*106/Kg、NK与T细胞的数量比值为0.14±0.09。而在未发生aGVHD组的患者，输注的移植物中NK细胞的百分比为（10.64±5.73）％、NK细胞绝对计数(20.66±10.57)*106/Kg、NK与T细胞的数量比值为0.20±0.11。aGVHD组与无aGVHD组间比较，NK细胞百分比例和绝对计数差别无统计意义，而NK∶T比值在无aGVHD组高于aGVHD组，P＜0.05。在移植后较长一段时间内，重建的NK细胞亚群分布与健康供者存在差异，在重建早期，CD56bright、NKG2A+和CD11b+CD27+这些相对不成熟的亚群的比例显著高于健康对照，随着时间推移，逐步发育成熟。移植后最早重建的NK细胞的NKG2A阳性率在aGVHD组为76.00±9.20％，高于无aGVHD组（59.59±6.10％）。移植后早期重建的NK细胞表达活化型受体NKP46与健康供者无显著差异，而NKG2D和CD226的水平较健康供者降低，其中NKG2D及CD226的水平在aGVHD组低于无aGVHD组。CD226的配体PVR在aGVHD组T细胞表面的表达水平为2470.39±1461.73，高于无aGVHD组（1440.81±648.44，P＜0.05）和健康供者（1148.91±281.64，P＜0.05）。T细胞表面表达Nectin2的水平在移植后aGVHD组与无aGVHD组无显著差异。NKG2D的配体MICA/B在移植后aGVHD组T细胞表面表达水平为3827.00±1849.34，高于无aGVHD组（1760.18±1010.87，P＜0.05）和健康供者（1570.82±1235.15，P＜0.05）。在aGVHD患者，NK细胞对活化T细胞的脱颗粒和细胞毒作用显著低于健康供者，采用IL-15激活能够部分逆转aGVHD患者NK细胞的表型和功能缺陷。
　　结论:NK细胞是造血干细胞移植后最早重建的淋巴细胞亚群，其数量和功能的重建影响aGVHD的进程。在我们的研究中发现，移植物中NK∶T细胞的比例与aGVHD的发生率相关。移植后重建的NK细胞表面DNAM-1/NKG2D活化型受体表达水平下降，而NKG2A水平增高，导致其杀伤活化T细胞和负向调节aGVHD的功能受损。NK细胞重建早期的DNAM-1/NKG2D表达水平与aGVHD的发生有关。Allo-HSCT后供者NK细胞亚群和受体的早期重建可能参与aGVHD的调节过程。
　　第二章 NK细胞抑制aGVHD中同种反应性T细胞应答的作用和机制
　　目的:本部分的目的是探讨供者来源的NK细胞在动物模型中对aGVHD中的同种反应性T细胞应答的调节作用，并通过体外实验进一步阐明相应的分子机制。
　　方法:建立小鼠MHC单倍体相合的aGVHD模型，在该模型基础上比较不同NK∶T细胞输注比例对小鼠aGVHD的调控作用，对供者T细胞增殖、凋亡以及T细胞亚群的影响;采用流式细胞仪分选供者PBMCs中的CD3+T细胞和CD56+NK细胞，采用PHA、Allo-DC、anti-CD3/CD28单抗刺激CFSE标记的供者T淋巴细胞增殖，比较加入不同比例的供者NK细胞抑制各种刺激引起的T淋巴细胞增殖的能力，采用CFSE-7AAD双标杀伤实验和基于CD107a释放的脱颗粒实验检测供者NK细胞对活化的供者T细胞的细胞毒功能，采用抗体阻断试验检测NK细胞杀伤活化T细胞过程中NKG2D、LFA-1、DNAM-1、FAS、NKG2A、TIM-3等受体的功能，采用Western blot检测与活化的T细胞相互作用后NK细胞内部ERK信号的磷酸化水平。
　　结果:1）在MHC单倍体相合的小鼠GVHD模型中，NK细胞能够抑制T细胞增殖、促进活化T细胞凋亡，具有GVHD保护作用;2）在淋巴细胞增殖实验中发现供者NK细胞能够抑制PHA、anti-CD3/CD28单抗以及异基因DC刺激引起的供者T细胞增殖，并且随着NK∶T细胞比例的增加，抑制作用也增强;3）在细胞毒实验中供者NK细胞能够选择性杀伤激活的供者T细胞，而对静息状态下的T细胞没有杀伤作用，脱颗粒实验也进一步证实NK细胞仅与激活T细胞共孵育才具有脱颗粒反应，不同亚群的NK细胞对活化T细胞的脱颗粒反应也不同，其中NKG2A+＞ NKG2A-，CD56dim＞ CD56bright;4）与静息状态相比，激活的T细胞表达更高水平的MICA/B、ULBP-1/4、PVR、ICAM-1等激活型NK受体的配体;5)抗体阻断实验结果提示NKG2D、DNAM-1、LFA-1促进NK细胞对活化T细胞的细胞毒作用，NKG2A、TIM-3抑制NK细胞对活化T细胞的细胞毒作用，FAS/FASL通路不参与这一过程;6)NK细胞与活化的自身T细胞接触后10-30min，ERK蛋白即出现快速的磷酸化。
　　结论:我们首先通过小鼠模型证实供者NK细胞能够抑制T细胞增殖、促进活化T细胞凋亡，具有GVHD保护作用。接着，我们首次在人体体外试验中证实同种抗原活化的供者T细胞通过上调NK细胞活化型受体的配体，激发供者NK细胞对自身活化T细胞的细胞毒作用，ERK信号参与NK细胞对活化T细胞的细胞毒作用。NK细胞通过LFA-1/NKG2D/CD226激活受体信号触发的细胞毒作用来负向调节同种抗原刺激的T细胞增殖的能力。
　　第三章干细胞动员剂和酪氨酸激酶抑制剂对NK细胞的aGVHD调节作用的影响
　　目的:最近研究表明某些移植合并用药可能会发挥免疫调节功能，本部分的目的是探讨移植中应用的干细胞动员剂AMD3100和靶向药物TKIs对NK细胞的移植物动员效应、生物学功能以及体外扩增的调节作用，旨在探寻能够充分激发Allo-HSCT中NK的GVL效应并增强NK细胞的GVHD调节功能的最佳方案。
　　方法:采用CB6F1小鼠作为受试对象，按干细胞动员方案分4组:(1)PBS对照组;(2)AMD3100组:5mg/Kg，单剂量腹腔注射;(3)G-CSF组:250mg/kg/d*5d，腹腔注射;(4)G-CSF+AMD3100组:剂量同上。给药后0h、1h、2h、4h尾静脉采血，通过细胞计数结合流式细胞仪检测NK细胞的动员效率;在给药后立即通过尾静脉按细胞数1∶1输注0.5uM和10uMCFSE标记的亲代小鼠C57BL/6(CFSElow)和CB6F1（CFSEhigh）的脾细胞，第4天应用FCM检测CFSElow和CFSEhigh细胞比例并计算NK细胞的体内杀伤率;在给药后4h获取小鼠的脾细胞，通过流式分选NK1.1+NK细胞，体外检测NK细胞对YAC-1细胞株的脱颗粒作用以及杀伤活性。
　　从健康成年人外周血中分离单个核细胞(PBMCs)，采用添加IL-2、IL-15的10％人AB血清的SCGM培养液进行NK细胞的扩增培养，在此培养体系中添加不同浓度的伊马替尼、尼洛替尼或者达沙替尼，采用细胞计数和FCM检测细胞表型比较三种TKIs对NK细胞体外扩增效率的影响;采用CFSE标记增殖试验检测达沙替尼对NK细胞抑制同种抗原刺激的T细胞增殖的影响;接着采用脱颗粒试验结合CFSE/7AAD细胞毒实验比较三种TKIs对NK细胞杀伤白血病细胞和激活T细胞功能的影响。
　　结果:5mg/kg的AMD3100单次注射能够有效的动员NK细胞，0h、1h、2h、4h外周血NK细胞绝对数分别是(4.89±0.83)*105/ml，(22.85±3.91)*105/ml，(34.77±2.82)*105/ml，(23.19±1.82)*105/ml;2h的NK数达到峰值，4h之后回落。单独采用G-CSF注射组则无NK细胞动员作用，AMD3100+G-CSF组与AMD3100组具有类似的NK细胞动员规律，在各时间点两组间的NK细胞绝对数无显著差异。在NK细胞体内杀伤实验中，G-CSF组对亲代细胞的排斥率为62.14±2.34％，低于PBS对照组69.09±2.64％; AMD3100组对亲代细胞的排斥率为80.67±4.87％，高于PBS对照组(P＜0.05)，AMD3100+G-CSF组与AMD3100组间无显著差异(P＞0.05)。在体外研究中，AMD3100组NK细胞的脱颗粒反应以及杀伤效率与PBS对照组间无显著差异，而G-CSF组以及G-CSF+AMD3100组NK细胞的体外细胞毒功能低于对照组。
　　三种TKIs中，只有达沙替尼能够在体外增加NK细胞的体外扩增效率，而伊马替尼和尼洛替尼不能促进NK细胞的扩增。随着培养体系中达沙替尼浓度的增加，NK细胞的纯度逐步升高，但是高浓度的达沙替尼还会引起NK细胞的凋亡，NK细胞的绝对数在20nM达到峰值。采用20nM的达沙替尼作用后的NK细胞能够更加有效地抑制同种抗原刺激后的自体T细胞增殖，并且达沙替尼能够增加NK细胞对活化T细胞以及白血病细胞的细胞毒作用。达沙替尼体外扩增的NK细胞中细胞毒功能较弱的NKG2A+CD57-亚群比例下降，而细胞毒功能较强的NKG2A-CD57+亚群比例增高。达沙替尼能够促进NK细胞表面的CD226、NKP46及NKG2D等活化型受体表达的上调。
　　结论:AMD3100用于造血干细胞移植的动员可以提高移植物中NK细胞的数量，增加移植物中NK∶T比例，并且不影响NK细胞的细胞毒功能。适当浓度的达沙替尼可以增强NK细胞体外扩增的效率，并能够上调扩增的NK细胞表面活化型受体的表达和优先扩增胞毒功能较强的NKG2ACD57+亚群，从而增强NK细胞对活化T细胞和AML细胞的细胞毒作用。我们的研究为目前Allo-HSCT中通过联合用药来降低GVHD的发生和保留GVL效应提供新的策略，并为下一步探索新的治疗靶点，开发新的药物打下研究基础。该部分研究内容已经发表于Transfusion杂志。