含EAB基团的两亲接枝聚膦腈载药自组装体的构建及抗肿瘤作用评价

摘要

纳米技术的迅速发展极大地推动了纳米载药系统在癌症治疗中的应用。近年来，一类被称为聚合物囊泡的新颖纳米自组装体吸引了人们的注意。相较于自组装胶束仅能装载疏水性药物，聚合物囊泡以类似脂质体的结构特点，不仅能装载疏水性药物也能装载亲水性药物，甚至能共载亲疏水性两种药物，极具开发潜力。本文选取聚膦腈作为聚合物主链，以分子量2000的聚乙二醇单甲醚（mPEG）为亲水性侧链和对氨基苯甲酸乙酯(EAB)为疏水性侧基进行修饰，通过mPEG/EAB投料比调节，合成一系列PEG接枝率不同的两亲性接枝聚膦腈(PEP)，又对聚合物结构进行核磁共振(NMR)、傅里叶红外光谱(FT-IR)和凝胶渗透色谱(GPC)表征。采用普通透析法即可简便制得该系列聚合物的纳米自组装体。通过TEM和cryo-TEM观察，PEG接枝率为0.89形成胶束，0.86形成过渡态，0.79至0.67形成囊泡。
　　为考察PEP装载亲疏水性药物的能力，本文分别以水溶性化疗药物盐酸阿霉素(DOX·HCl)及其脱盐产物疏水性阿霉素(DOX)作为模型药物，采用透析法装载，结果表明聚合物中疏水基团EAB接枝率上升将促进PEP的药物装载。尤其，PEP-5装载DOX·HCl或DOX均能获得高载药量(LC)和包封率(EE)。其中，载DOX·HCl的PEP-5系统(PEP-5-DH) LC为16.23％，载DOX的PEP-5系统(PEP-5-D)LC为15.55％，两者对应EE均高于90％，PEP-5-DH为97.30％，PEP-5-D为93.30％。经2D1H-1H NOESY检测，证明载体与药物间存在极强分子间作用力，有利于载药。药物释放实验表明，DOX·HCl从PEP载药系统的释放较DOX快，且与pH条件有关。MCF-7细胞毒性实验发现，载体本身几乎无毒。PEP-5-DH与游离DOX·HCl毒性相近，而PEP-5-D，由于药物水溶性不佳释放缓慢，导致细胞毒性减弱。由PEG修饰形成的纳米自组装体被广泛报道具有增强渗透与滞留(EPR)效应相关的肿瘤被动靶向性，能降低化疗药物毒副作用，因此本课题构建了MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠模型，对PEP载药系统进行体内评价。结果表明，PEP载体、药物亲水性及给药方案均对药效产生不同影响。实验过程中，PEP载药的剂型相比游离DOX·HCl毒性明显减小。药效方面，虽然2 mg/kg每天1次连续3天方式的给药总量比5 mg/kg每3天给1次共3次的方式更低，但2 mg/kg对应组的疗效更佳。采用相同的给药方式，PEP-5-DH的抑瘤效果明显优于PEP-5-D，已与游离DOX·HCl相当，但安全性却较游离DOX·HCl显著提高，达到了降低化疗药物毒副作用的同时，不牺牲药物疗效的目的。
　　为克服MCF-7/Adr肿瘤细胞对阿霉素的耐药性，本文还利用PEP自组装囊泡的独特结构共载DOX·HCl或DOX和氯喹(CQ)。CQ为一种传统抗疟药物，但也被报道具有抗肿瘤药物增敏作用，已在临床试验中进行研究。与之相关的机制可能是抑制耐药蛋白的外排，也可能与促癌干细胞(CSC)凋亡相关。细胞毒性实验发现阿霉素和CQ联合用药可显著逆转耐药，通过Chou-Talalay联合指数法计算证实两者具有协同作用且随CQ比例的增加而增强。为了更好的地模拟体内环境，本文构建了耐药性MCF-7/Adr细胞3D肿瘤球模型，并采用激光共聚焦(CLSM)断层扫描及扫描电镜(SEM)对各试验组的肿瘤球内渗透剂抑瘤效果进行评价。相比游离DOX·HCl只能停留在肿瘤球表面，CQ和DOX·HCl联合用药能更好地渗透进入肿瘤深部，渗透效果最好的是按DOX·HCl和CQ以1∶1比例共载的PEP制剂(PEP-DHC-1)，能完全渗透进入肿瘤深部，且给药7天后，肿瘤球明显瓦解。流式凋亡检测证实PEP-DHC-1处理的肿瘤球凋亡率也最高，提示该载药自组装体有望在动物体内逆转耐药，提高阿霉素的抗肿瘤疗效。
　　总之，PEP作为一种新型纳米自组装药物载体，具有高效装载亲水性或疏水性药物能力，可在抗肿瘤治疗方面，保证安全性并提高药效，值得进行深入研究。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

第一章 绪论

1．1 纳米药物传递系统研究

1．1．1 聚合物胶束

1．1．2 脂质体

1．2 肿瘤化疗研究

1．2．1 传统化疗药物问题

1．2．2 靶向制剂

1．2．3 肿瘤耐药逆转方法

1．3 课题的提出

第二章 两亲接枝聚膦腈共聚物PEP的合成及表征

2．1 原料和实验仪器

2．1．1 原料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 PEP系列聚合物制备

2．2．2 PEP系列聚合物性质表征

2．2．3 PEP系列聚合物空白纳米粒制备

2．3 结果与讨论

2．3．1 PEP系列聚合物FT-IR表征

2．3．2 PEP系列聚合物1H NMR和GPC表征

2．3．3 空白PEP纳米粒表征

2．4 小结

第三章 PEP装载亲／疏水性阿霉素及评价

3．1 原料和实验仪器

3．1．1 原料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 载药制备

3．2．2 载药性能表征

3．2．3 体外药效

3．2．4 体内抗肿瘤实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 载药能力评价

3．3．2 PEP与阿霉素相互作用

3．3．3 PEP载药纳米粒的粒径及形态

3．3．4 载药储存稳定性研究

3．3．5 体外药物释放

3．3．6 体外细胞毒性

3．3．7 体外细胞摄取

3．3．8 体内抗肿瘤药效

3．4 小结

第四章 PEP共载阿霉素与CQ及评价

4．1 原料和实验仪器

4．1．1 原料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 载药制备

4．2．2 载药性能表征

4．2．3 体外药效

4．2．4 3D肿瘤球实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 载药能力评价

4．3．2 体外药物释放

4．3．3 体外细胞毒性

4．3．4 体外细胞摄取

4．3．5 3D肿瘤球渗透实验

4．3．6 3D肿瘤球生长抑制实验

4．4 小结

第五章 结论

5．1 全文总结

5．2 论文创新点

5．3 研究过程中的不足与展望

参考文献

综述 纳米医药------聚合物囊泡的应用进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果