面向芍药双苷生物制备的芍药愈伤组织的诱导及培养条件优化研究

摘要

芍药双苷是从芍药根中提取获得的一种生理活性物质，它能通过多种途径抑制自身免疫反应，具有抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多种药理作用，对类风湿性关节炎具有确切疗效。为了提高芍药双苷的制备效率，本文采用植物组织培养技术，开展了芍药愈伤组织的诱导和培养研究，并采用单因素实验和多种统计优化方法对愈伤组织的培养基及培养条件进行了考察和优化，促进了愈伤组织的生长，提高了愈伤组织中芍药双苷的积累水平，初步显示出通过植物细胞工程手段制备芍药双苷的可行性和优越性。
　　通过优选愈伤组织的诱导条件，成功诱导多种芍药外植体（根、茎、叶、叶柄）产生愈伤组织，并考察了诱导条件和外植体类型对愈伤组织诱导效率的影响，确定了最佳的愈伤组织诱导条件。同时建立了愈伤组织中芍药双苷的提取、检测和鉴定方法，确定了最适的反相HPLC色谱分析条件:Sino Chrom ODS-BP(4.6mm×250mm，5μm);流动相为乙腈/0.05％磷酸二氢钾水溶液(11/89，V/V);流速为1.0 ml/min;进样量为20μl;检测波长为230 nm。检测发现，愈伤组织（培养40天）中芍药双苷的含量高于天然植株（生长）中芍药双苷的含量。
　　以生长好、芍药双苷含量较高的芍药叶片及根愈伤组织为研究对象，通过单因素实验，考察基本培养基类型、培养基中碳源、微量元素、pH值以及光照等因素对愈伤组织生长及芍药双苷积累水平的影响。结果表明，适合芍药双苷积累的愈伤组织培养条件为:培养基为WPM+0.5 mg/L6-BA+1.0 mg/L NAA+0.1mg/L TDZ， pH为6.5，培养室温度为24℃，光照强度为1500 lx，愈伤组织培养时间为40天。在所考察的三种糖类（蔗糖、麦芽糖、葡萄糖）中，蔗糖最有利于愈伤组织生长及芍药双苷的积累。培养基中添加少量亚硒酸钠盐(0.25mg/L)也可使芍药双苷的积累水平提高96％。在此基础上，采用Plackett-Burman设计从众多影响愈伤组织中芍药双苷积累水平的因素中筛选出了影响最为显著的三个关键要素:蔗糖含量、植物激素6-BA及NAA浓度，然后通过最陡爬坡实验和基于中心组合设计的响应面优化方法确定这三个关键要素的最适水平，使芍药愈伤组织中芍药双苷的含量较原始培养条件的浓度提高了33％，取得了较好的优化效果。

目录

声明

论文说明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 引言

1．2 芍药的研究概况

1．2．1 芍药概述

1．2．2 芍药的化学成分

1．2．3 芍药双苷的研究概况

1．3 药用植物组织培养生产次级代谢产物的研究进展

1．3．1 植物组织培养概念及发展简史

1．3．2 植物组织培养生产次生代谢产物研究概况

1．3．3 影响植物组织培养生产次级代谢产物的因素

1．3．4 植物组织培养优化策略

1．3．5 芍药属组织培养研究进展

1．4 论文研究主要目的和内容

1．4．1 研究目的及内容

1．4．2 技术路线

2 芍药愈伤组织的诱导、培养及其芍药双苷含量的测定

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 愈伤组织诱导培养

2．3．2 愈伤组织继代培养

2．3．3 愈伤组织中芍药双苷的提取及测定

2．4 本章小结

3 培养条件对芍药愈伤组织生长及芍药双苷积累水平的影响

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料

3．2．2 实验方法

3．2．3 分析方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 不同培养基对愈伤组织生长及芍药双苷含量的影响

3．3．2 pH值对愈伤组织生长及芍药双苷含量的影响

3．3．3 碳源对愈伤组织生长及芍药双苷含量的影响

3．3．4 微量元素硒对愈伤组织生长及芍药双苷含量的影响

3．3．5 光照条件对愈伤组织生长及芍药双苷含量的影响

3．3．6 培养时间对愈伤组织生长及芍药双苷含量的影响

3．3．7 继代次数对愈伤组织生长及芍药双苷含量的影响

3．3．8 低温保藏对愈伤组织继代的影响

3．4 本章小结

4 高产芍药双苷的愈伤组织最优培养条件的确定

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料

4．2．2 实验方法

4．2．3 分析方法

4．2．4 实验设计方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 影响芍药愈伤组织合成芍药双苷能力的关键因素

4．3．2 最陡爬坡实验

4．3．3 响应面的拟合及最优条件确定

4．4 本章小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

作者简历