肠淋巴液致失血性休克大鼠急性肾损伤的基因组学与蛋白质组学研究

摘要

严重创伤、失血、失液、烧伤、手术意外、交通事故以及包括地震等自然灾害在内的多种严重致病因素，均可引起机体有效循环血量减少，导致失血性休克(hemorrhagic shock，HS)的发生。失血性休克后肾损伤引起的内环境紊乱，成为失血性休克导致多器官损伤或多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)的关键环节。研究表明，失血性休克状态下肠淋巴液回流至全身，是引起多器官损伤的重要发病机制;以肠淋巴管结扎或肠淋巴液引流为手段减少肠淋巴液回流，可减轻失血性休克后的急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)，其机制涉及降低自由基、一氧化氮、促炎介质的生成与释放、提升细胞膜泵活性、减少细胞凋亡、减少经肠淋巴途径的细菌内毒素移位(bacteria/endotoxintranslocation，BET)等方面。肠淋巴液回流加重AKI或者减少肠淋巴液回流减轻AKI的机制，还需要深入观察。
　　目的:
　　本研究旨在已明确肠淋巴液回流是失血性休克后AKI重要发病机制的工作基础上，应用基因组学与蛋白质组学技术，观察肠淋巴管结扎对失血性休克大鼠肾组织基因表达谱以及肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾组织蛋白表达谱的影响，筛选失血性休克后肠淋巴液引起AKI的差异表达基因与差异表达蛋白，深入揭示淋巴液在失血性休克后AKI发病机制中的作用，为以淋巴为靶向防治重症休克及其引起的AKI提供实验依据与理论基础。
　　方法:
　　1)肠淋巴管结扎对失血性休克大鼠肾组织基因表达谱的影响
　　Wistar雄性大鼠20只，随机分为休克组与休克肠淋巴管结扎组，全身麻醉后，在无菌手术下，行左侧颈总动脉和右侧颈静脉插管，备监测平均动脉血压(meanarterial pressure，MAP)放血与液体复苏;腹部手术，钝性分离肠淋巴管与肠系膜上动脉，备肠淋巴管结扎或假结扎;待所有手术完成稳定10 min后，应用自动抽注机自颈总动脉缓慢放血（失血量以全血量的1/5计，全血量以体重1/13计），3 min完成;通过放血或输血，维持低血压(40mmHg)90min，复制失血性休克模型。随后，将放出的全血与林格氏液（量为全血量）混合，应用自动推注机经右侧颈静脉缓慢匀速回输，进行液体复苏，速度50 mL/h，时间≥20 min。输液复苏后休克肠淋巴管结扎组行肠淋巴管结扎，休克组仅在肠淋巴管下穿线;于输液复苏后3h，于深麻醉状态下，留取左肾。然后，制备匀浆，提取总RNA，反转录cDNA，制备Cy3和Cy5标记的cDNA探针，与包含12028种基因的大鼠全基因组cDNA芯片杂交，分析差异表达基因。另取6只大鼠，再次复制失血性休克模型，并实施肠淋巴管结扎技术，留取肾组织，提取RNA，应用实时荧光定量PCR(real-timefluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)方法验证部分差异基因表达。
　　2)肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾组织差异蛋白质组学的影响
　　健康SPF级Wistar雄性大鼠27只，随机分为3组:假手术组、休克组、休克引流组(n=9)。大鼠在戊巴比妥钠全身麻醉后，行股部手术，分离右侧股静脉和股动脉，插管后用于液体复苏和MAP监测;然后，分离左侧股动脉后插管，通过注射器连接于抽注机上备放血。随后，游离肠淋巴管(mesenteric lymph duct，MLD)，备肠淋巴液引流或假引流。待稳定30 min后，经左股动脉、应用抽注机缓慢匀速放血，10 min内将MAP降至40 mmHg，实验过程中通过推注机调整放血量维持MAP在（40±2）mmHg水平，复制失血性休克模型。维持低血压60 min后，将放出全血加等量林格氏液通过微量输液泵经右股静脉行液体复苏，30 min完成。输液结束后180 min，休克+引流组行肠淋巴管插管，常规方法引流肠淋巴液。在深麻醉状态下，于相应时间点，收集每只大鼠的左侧肾脏，保存于-80℃C低温冰柜中，应用二维荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gelelectrophoresis，2-DIGE)进行蛋白质组学分析。操作步骤如下:制备肾组织匀浆，去高丰度蛋白并应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)验证，第一向等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)，第二向SDS-PAGE，银染，扫描与数据处理，凝胶考染。选择表达升高或降低1.5倍的差异蛋白，进行胰蛋白酶消化，点靶后，采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ ionizationtime-of-flight，MALDI-TOF）进行质谱分析与鉴定。进一步，应用ELISA技术鉴定部分差异蛋白。
　　结果:
　　1)肠淋巴管结扎对失血性休克大鼠肾组织基因表达谱的影响
　　在大鼠肾组织基因组转录水平，获得了5，812个有效数据。其中，两组基因转录变化在2倍以上的基因个数有56个，肠淋巴管结扎引起了失血性休克大鼠肾组织的25个基因上调、31个基因下调。
　　在肠淋巴管结扎上调失血性休克肾组织的25个基因中，有11个为已知基因，包括:视锥蛋白样1(visinin-like1，Vsnl1)、G耦联蛋白P2Y1嘌呤受体（purinergic receptor P2Y, G-protein coupled，1，P2ry1）、ATP结合盒转运亚家族D成员2(ATP-binding cassette，subfamily D(ALD)，member2，Abcd2)、溶质载体家族13成员5(solute carrier family13(sodium-dependent citrate transporter), member5，Slc13a5)、与钾通道4超极化相关活化环核苷酸(hyperpolarization activatedcyclic nucleotide-gated potassium channel4，Hcn4)、FMS相关的酪氨酸激酶1（FMS-related tyrosine kinase1，Flt1）、巨噬细胞游走抑制因子(macrophagemigration inhibitory factor，Mif)、泛素化特异酶7(ubiquitin specific peptidase7，USP7)、输入蛋白5(importin5，Ipo5)、突触小泡蛋白1(synaptophysin-like1，Sypl1)、富含半胱氨酸与组氨酸区域(cysteine and histidine-rich domain(CHORD)-containing1，Chordc1)，这些上调基因编译的蛋白功能涉及信号转导、代谢、运输、细胞运动等。
　　在肠淋巴管结扎下调失血性休克肾组织的31个基因中，有23个为已知基因，包括:切割蛋白(cutA divalent cation tolerance homolog，Cuta)、γ氨基丁酸受体相关蛋白(GABA(A) receptor-associated protein，Gabarap）、kruppel样因子6(kruppel-like factor6，Klf6)、RNA聚合酶Ⅱ多肽L(polymerase(RNA)Ⅱ(DNAdirected) polypeptide L，Polr21）、RNA聚合酶Ⅱ多肽E(polymerase(RNA)Ⅱ(DNAdirected) polypeptide E，Polr2e)、核酸内切酶G(endonuclease G，Endog)、尿调节素(uromodulin，Umod)、延胡索二酰乙酰水解酶(fumarylacetoacetatehydrolase，Fah)、蛋白磷酸酶1(protein phosphatase1，catalytic subunit，alphaisozyme，Ppp1 ca)、线粒体F1片段ATP合成酶(ATP synthase，H+ transporting，mitochondrial F1 complex，delta subunit，Atp5d)、硫代硫酸盐硫基转移酶（thiosulfate sulfurtransferase，Tst）、谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase，Gss)、谷胱甘肽s转移酶m1(glutathione S-transferase mu1，Gstm1)、谷胱甘肽s转移酶p1(glutathione S-transferase pi1，Gstp1)、跨膜蛋白150A(transmembraneprotein150A，Tmem150a)、线粒体内膜移位酶(translocase of inner mitochondrialmembrane13 homolog(yeast)，Timm13)、叶酸受体1(folate receptor1，Folr1)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1，Ccnd1)、核糖核酸酶K(ribonuclease，RNase K，Rnasek)、钙黏蛋白2(cadherin2，Cdh2)、激肽释放酶相关蛋白酶C7(kallikrein1-related peptidase C7，Klk1c7)、脱氧核糖核酸酶1(deoxyribonuclease1，Dnase1)、WAS蛋白家族1（WAS protein family, member1，Wasf1），这些下调基因编译的蛋白功能涉及信号转导、转录调控、代谢、运输、细胞发育、细胞周期、细胞黏附、细胞成分和生物发生等。
　　qRT-PCR验证结果显示，肠淋巴管结扎降低了失血性休克大鼠肾组织Cdh2、Gss、Tst mRNA表达，提高了Mif mRNA表达;研究结果与DNA芯片结果是一致的。
　　2)肠淋巴液引流对失血性休克大鼠肾组织差异蛋白质组学的影响
　　获取了5张IPG胶条用于后面的差异蛋白质组学分析，经DeCyder6.5软件处理，发现了大约2，000左右的蛋白斑点。经过生物信息学模块分析，发现在失血性休克组与假手术组大鼠肾组织的差异蛋白表达中，有5个蛋白斑点灰度超过或低于1.5倍;在休克+引流组与假手术组中，有12个差异表达蛋白表达上调或下调;在休克+引流组与休克组中，有3个差异表达蛋白表达上调或下调。通过视觉观察，去除冗余蛋白，有14个蛋白斑点被选择用于MALDI-TOF/TOF质谱鉴定分析。9个蛋白斑点被成功鉴定，这些蛋白经过功能分类为:细胞增殖、能量代谢、细胞运动与细胞骨架;其它5个蛋白斑点经质谱鉴定后，有效积分值未超过59。
　　与假手术组比较，失血性休克组大鼠肾组织的不均一核糖核酸核蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，hnRNPC）、丝氨酸-苏氨酸激酶受体相关蛋白（serine-threonine kinase receptor-associated protein，Strap）表达降低;失血性休克引流肠淋巴液肾组织的线粒体三功能酶亚基α(trifunctional enzyme subunitalpha，mitochondrial，Hadha)、溶解载体家族25成员13(solute carrier family25，member13，Slc25a13)、线粒体的ATP合酶亚基β(ATP synthase subunit beta，mitochondrial，Atp5b)、肌动蛋白(actin)的多种亚基[如:骨胳肌源的actinα(actin，alpha skeletal muscle，Acta1)、肠平滑肌源的actinγ(actin，gamma-enteric smoothmuscle，Actg2)、33 kDa蛋白(33 kDa protein，Actg1)、前肽样actinγ1(actin，gamma1 propeptide-like，LOC684969)]、40S的核糖体蛋白S3(40S ribosomal protein S3，Rps3)以及hnRNPC与Strap均显著降低。进一步发现，失血性休克引流肠淋巴液的肾组织肌动蛋白(actin)的多种亚基[如:心肌源的actinα1(actin，alpha cardiacmuscle1，Actc1)、大动脉平滑肌源的actin(actin，aortic smooth muscle，Acta2)、细胞质的actin1(actin，cytoplasmic1，Actb)以及Actg2]以及Atp5b显著低于休克组。
　　ELISA验证结果显示，在失血性休克组与假手术组之间，肾组织Atp5b与Actg2水平无显著差异;休克+引流组肾组织Atp5b与Actg2水平均显著低于失血性休克组与假手术组。
　　结论:
　　1)本研究应用DNA芯片分析技术，查找、筛选、发现了结扎肠淋巴管阻断肠淋巴液回流可引起失血性休克后肾组织的34个已知基因出现差异表达，这些差异表达基因编码蛋白的功能主要涉及信号转导、转录调控、代谢、运输、细胞发育、细胞周期、细胞黏附、细胞成分和生物发生等方面。研究结果提示，肠淋巴管结扎减轻失血性休克肾损伤的机制与上调或下调和上述功能相关基因的差异表达有关。
　　2)本研究应用蛋白质组学技术，经质谱鉴定，发现了失血性休克后肾组织出现了一些差异表达的蛋白，肠淋巴液引流也降低了一些差异蛋白的表达。这些蛋白的功能涉及细胞增殖、能量代谢、细胞骨架与运动等。研究结果提示，这些差异表达的蛋白可能与失血性休克引起的急性肾损伤有关，也可能参与了肠淋巴液引流减轻急性肾损伤的作用。