白菜与黑芥远缘杂交及其多倍化过程中表型、遗传及表观遗传变异研究

摘要

在远缘杂交与多倍化过程中，植物会产生不同的基因组反应，涉及遗传与表观遗传的改变。遗传改变包括基因组片段缺失、碱基改变、rDNA位点改变以及染色体重组等，而表观遗传改变主要涉及DNA甲基化修饰、组蛋白修饰及small RNA调控的改变等。遗传与表观遗传的改变对于杂交后代的性状形成具有重要影响，如杂种优势的形成。本研究通过白菜（Brassica rapa，基因组:AA）与黑芥(Brassica nigra，基因组:BB)的远缘杂交及其染色体加倍，观察到远缘杂种二倍体(AB)、异源四倍体(AABB)、亲本之间存在显著的表型差异。在此基础上，首先，利用相关序列扩增多态性标记（SRAP）分析了白菜与黑芥杂交及多倍化过程中的基因组遗传改变差异;其次，运用甲基化敏感扩增多态性标记(MSAP)分析了白菜与黑芥杂交及多倍化过程中的DNA甲基化模式与水平的差异;最后，通过small RNA高通量测序，系统地分析了白菜与黑芥杂交及多倍化过程中small RNA的差异，以期揭示small RNAs对远缘杂种及其多倍体性状的影响。本文初步探究了白菜与黑芥远缘杂交及其多倍化过程中的表型、遗传及表观遗传的变化，为园艺作物的遗传改良和新品种的创制提供新理论依据。主要研究结果如下:
　　(1)以白菜（♀，AA）与黑芥(♂，BB)为亲本进行远缘杂交，通过秋水仙素处理异源二倍体（基因组:AB）诱导得到异源四倍体（基因组:AABB）和异源非整倍体。通过观察异源二倍体、T-异源二倍体（秋水仙素处理过的异源二倍体）、异源四倍体和异源非整倍体的生长情况，发现AABB与AB相比，表现出明显的生长优势。
　　(2)通过SRAP分析了白菜与黑芥远缘杂交及其多倍化过程中基因组的遗传改变。结果表明:21.07％的AABB片段显示出了多态性，而AB中的多态性片段只有10.60％，其中，AABB中表现的新增片段是AB的两倍。将新增的多态性片段在NCBI中进行比对分析，部分片段匹配到了同源的功能基因。此外，本实验观察到AABB自交得到的F2各植株间表现出相同的表型和基因模式。因此，我们推测在异源基因组的组合及染色体加倍过程中，基因组的遗传变化的程度与多倍化水平呈正相关;远缘杂交和染色体加倍都能影响新合成的异源多倍体的基因组结构，并且新增片段可能与新表型的形成有关。
　　(3)通过MSAP分析了白菜与黑芥远缘杂交及多倍化过程中DNA甲基化模式和水平的改变，结果表明，AB甲基化模式改变的比例显著高于AABB，然而，AB和AABB的甲基化水平都低于亲本。因此，随着多倍化水平的提高，DNA的甲基化水平呈现下降趋势。
　　(4) small RNA高通量测序的结果表明，AB与AABB的miRNAs表达水平与亲本相比较都呈现上升趋势，其siRNAs表达水平比白菜相比呈上升趋势，而与黑芥相比呈下降趋势。此外，随着倍性水平的提高，miRNAs比例增大，而siRNAs的比例减小。从亲本、杂交种、多倍体中一共得到320个已知miRNAs和52个新miRNAs。并且通过定量实时多聚酶链反应(qRT-PCR)分析发现，目标基因的表达水平与miRNAs表达呈负相关。因此，miRNA表达水平的改变调控了基因的表达，并引起了杂种的表型变异，这在异源四倍体的杂种优势形成过程中发挥重要的作用。