禽偏肺病毒mRNA甲基转移酶缺陷弱毒疫苗株的研究

摘要

禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV），又称火鸡鼻气管炎病毒（Turkeyrhinotracheitis virus，TRTV），早期称为禽肺病毒(Avian pneumovirus，APV)，该病毒最早于1978年从南非发病火鸡中分离得到，之后在世界范围内蔓延传播。aMPV是副粘病毒科、肺病毒亚科、偏肺病毒属成员，有囊膜，属单节段负链RNA病毒。病毒mRNA的加工处理对病毒基因的表达与病毒基因组的复制至关重要，mRNA的加工处理过程包括加帽、甲基化和聚腺苷酸化。其中加帽和甲基化对mRNA的稳定、翻译及基因表达最为重要，这些加工过程需要一系列的酶促反应，AMPV复制过程中的上述一系列酶促反应均由其L蛋白负责完成。对于单股负链RNA病毒而言，其L蛋白包括六个高度保守的功能域，分别为CRⅠ、CRⅡ、CRⅢ、CRⅣ、CRⅤ和CRⅥ功能域。单股负链RNA病毒具有独特的mRNA甲基化机制。生物信息学分析显示，aMPV L蛋白CRⅥ功能域具有guanine-N-7(G-N-7)和ribose2'-O(2'-O)甲基转移酶催化活性，这两个甲基转移酶活性位点共用一个甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合位点。
　　基于生物信息学分析，我们对aMPV L蛋白CRⅥ功能域预测的MTase催化位点及S-腺苷甲硫氨酸结合位点进行氨基酸定点突变，并运用反向遗传学系统，成功拯救了raMPV-G1696A、raMPV-G1700A、raMPV-N1701A和raMPV-D1755A四株aMPV科罗拉多株(Colorado)重组病毒。体外甲基化研究结果显示，四株重组病毒在2'-O位点的甲基化有明显的消减，但在G-N-7位点的甲基化却几乎未受影响。另外，进一步的两步甲基化试验证明G-N-7位点的甲基化先于2'-O位点的甲基化且前者对后者有促进作用。重组病毒蚀斑试验和生长特性分析表明，四株重组病毒在细胞上培养时高度致弱，且保持着良好的遗传稳定性。
　　为进一步验证aMPV甲基转移酶缺陷株是否可以作为弱毒疫苗进行开发，本研究开展了重组病毒的动物试验研究。通过点眼、滴鼻途径将5×106 PFU的重组病毒接种2周龄火鸡，研究重组病毒在火鸡内的致病性和免疫原性。结果显示，四株甲基缺陷性重组病毒在火鸡呼吸道内的复制能力均降低，并且可以诱发高水平的中和抗体，可以完全保护火鸡免受同源性野生型aMPV科罗拉多株(aMPV/CO)和异源性野生型aMPV明尼苏达株（aMPVMN）的攻毒感染。
　　总之，体外试验显示，缺少2'-O位点甲基化的重组禽偏肺病毒（raMPV），高度致弱且保持着良好的遗传稳定性，动物试验表明，raMPV对天然宿主火鸡具有很好的免疫原性。因此甲基转移酶缺陷型重组病毒可作为aMPV理想的疫苗候选株。此外，甲基化位点突变使raMPV致弱的策略可望用于其它禽类和人类副粘病毒疫苗的研制开发。

目录

声明

摘要

第一部分 文献综述

1．禽偏肺病毒分类地位

2．流行病学及临床特征

3．诊断学研究

4．禽偏肺病毒基因组结构及蛋白特性

4．1 核蛋白(nucleocapsid protein，N)

4．2 磷蛋白(phosphoprotein，P)

4．3 基质蛋白(matrix protein，M)

4．4 融合蛋白(fusion protein，F)

4．5 糖蛋白(glycoprotein，G)

4．6 小疏水蛋白(small hydrophobic protein，SH)

4．7 基质蛋白M2

4．8 大多聚酶蛋白(large subunit of the Polymerase，L)

5．禽偏肺病毒的复制及侵染机制

6．禽偏肺病毒反向遗传学研究

7．禽偏肺病毒的RNA甲基化酶的功能位点研究

8．禽偏肺病毒的控制及疫苗研发

8．1 疫苗的研发

8．2 疾病的治疗与控制

9．本研究的意义

第二部分 研究内容

第一章 禽偏肺病毒mRNA甲基化过程RNA结合位点生物信息学分析

1．引言

2．生物学软件的应用与分析

3．单节段负链(NNS)RNA病毒L蛋白第Ⅵ功能域序列分析

4．结果

第二章 禽偏肺病毒科罗拉多株(aMPV／CO)突变体病毒的拯救及特性分析

1．引言

2．材料和方法

3．结果

4．讨论

第三章 禽偏肺病毒甲基转移酶缺陷株致病性研究

1．引言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

第四章 禽偏肺病毒甲基转移酶缺陷株免疫原性研究

1．引言

2．材料与方法

3．结果

4．讨论

第五章 结论与展望

结轮

研究展望

参考文献

主要名词缩写

作者简介

攻读博士期间的科研成果

致谢