神经酰胺在MCLR引起的HL7702细胞PP2A亚基及其底物改变中作用的探讨

摘要

研究背景:微囊藻毒素LR(MCLR, microcystin-LR)是微囊藻毒素中存在最为普遍且毒性作用最明显的一种。MCLR是蛋白磷酸酶2A(PP2A，protein phoshatase2A)的强抑制剂，对PP2A的抑制作用可能是造成其致毒作用机制错综复杂的原因之一。神经酰胺是细胞对外界环境刺激产生的一类主要的第二信使，PP2A/B55α亚基和PP2A/B56α亚基可被神经酰胺激活。本实验室的前期研究发现，MCLR能够刺激人胚肾细胞HEK293和小鼠肾脏中神经酰胺水平的升高，升高的神经酰胺上调了HEK293细胞中PP2A/B55α以及PP2A/B56α这两种调节亚基的蛋白水平。本研究拟探讨MCLR染毒人肝细胞HL7702后神经酰胺在PP2A亚基改变及其底物蛋白磷酸化水平改变中的作用。
　　研究方法:以人肝细胞系HL7702为模型，对细胞用MCLR染毒及用神经酰胺合成酶抑制剂Desipramine(DESI)处理，应用免疫荧光技术检测神经酰胺水平，用免疫印迹技术检测PP2A各亚基蛋白水平及其底物MAPK、c-myc、Raf-1、Akt、bcl-2、Ezrin、VASP和Hsp27的总蛋白及磷酸化蛋白水平，用Hoechst33342染核方法检测细胞凋亡。
　　研究结果:1.MCLR对HL7702细胞处理24小时后，神经酰胺水平明显升高。用10μM DESI与MCLR共处理HL7702细胞后，神经酰胺水平的上升得到了抑制。2.MCLR与DESI共处理细胞后，MCLR引起的PP2A/B55α和PP2A/B56α蛋白水平上调效应消除。但是DESI共处理不影响MCLR引起的PP2A/A和PP2A/C亚基蛋白水平的变化。3.MCLR影响了PP2A底物MAPK、c-myc、Raf-1、Akt、bcl-2、Ezrin、VASP、Hsp27的磷酸化水平，其中c-myc、Akt、bcl-2、Hsp27在加入DESI后其磷酸化水平的升高被抑制。4.虽然bcl-2的磷酸化水平上升，但未检测出MCLR对HL7702细胞的细胞凋亡产生可见影响，DESI的加入也没有改变这个结果。
　　研究结论:HL7702细胞在受到MCLR刺激后，主要经神经酰胺合成途径使神经酰胺水平升高;升高的神经酰胺上调了PP2A/B55α以及PP2A/B56α这两种调节亚基的蛋白水平;与此同时，也影响了MCLR引起的PP2A底物c-myc、Akt、bcl-2、Hsp27蛋白磷酸化水平的升高。表明在MCLR的作用过程中，神经酰胺可能起到了一定的调节作用，但具体的机制还有待深入研究。

目录

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致谢

摘要

缩略词表

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4．实验结果

4．1 MCLR刺激HL7702细胞的神经酰胺水平升高

4．2 神经酰胺合成酶抑制剂DESI抑制神经酰胺的合成

4．3 MCLR刺激HL7702细胞调节PP2A亚基水平可能与神经酰胺有关

4．4 神经酰胺在MCLR诱导的MAPK通路磷酸化水平改变中的作用

4．4．1 神经酰胺没有影响MCLR引起的Raf-1磷酸化水平改变

4．4．2 神经酰胺没有影响MCLR引起的ERK1／2，p38，JNK磷酸化水平改变

4．4．3 MCLR引起MAPK下游转录因子c-myc的磷酸化可能与神经酰胺有关

4．5 神经酰胺在MCLR影响细胞存活／凋亡相关蛋白磷酸化水平中的作用

4．5．1 MCLR影响Akt蛋白磷酸化水平可能与神经酰胺有关

4．5．2 MCLR影响bcl-2蛋白水平及其磷酸化水平可能与神经酰胺有关

4．6 神经酰胺在MCLR影响细胞骨架相关蛋白磷酸化水平中的作用

4．6．1 神经酰胺没有影响MCLR引起的Ezrin磷酸化水平改变

4．6．2 神经酰胺没有影响MCLR引起的VASP磷酸化水平改变

4．6．3 MCLR影响Hsp27蛋白磷酸化水平可能与神经酰胺有关

4．7 MCLR对HL7702细胞凋亡没有影响

5 讨论

5．1 MCLR通过刺激HL7702细胞生成神经酰胺调节PP2A亚基的蛋白水平

5．2 MCLR激活MAPK通路及其引起c-myc、Raf-1的磷酸化可能与神经酰胺有关

5．3 MCLR影响细胞存活／凋亡相关蛋白可能与神经酰胺有关

5．4 MCLR影响细胞骨架相关蛋白可能与神经酰胺有关

6 结论

参考文献

14-3-3蛋白研究的当前进展和未来方向

作者简历及在学期间参加的科研工作